油料作物种子中神经酸含量提升研究进展

摘要 神经酸（NA）是一种超长链单不饱和脂肪酸，为大脑神经纤维髓鞘的核心成分，具有修复受损大脑神经纤维、促进神经细胞再生等功能。因此，NA 受到越来越多的研究和关注。目前NA 主要依赖于从天然物种中提取，难以满足市场需要，限制其进一步发展和应用。近年来，随着基因工程以及合成生物学的发展，通过多基因策略，在现有物种中构建NA 代谢路径，可经济且可持续地获得NA，以满足营养、制药和化学工业等领域的需求。本文综述了NA 的生物功能、生物来源、合成途径，并比较了基因工程生产NA 各底盘的优劣，进一步探讨了十字花科油料作物底盘生产富含NA 种子油的影响因素，以期为将来通过转基因技术和分子育种调控NA 的生产，获得可再生的NA 资源提供一定的思路和策略。

关键词 神经酸； 基因工程； 底盘； 转基因； 分子育种； 十字花科油料作物； 种子油

中图分类号 Q819∶S565 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2024）02-0064-11

神经酸（nervonic acid，NA）学名为15-二十四碳烯酸（C24∶1），最初在鲨鱼大脑中分离得到，故又名鲨油酸［1］。其分子式为C24H46O2，相对分子质量为366.6，纯品在常温状态下为白色针状固体，溶于醇，不溶于水，是一种ω-9 型长链单不饱和脂肪酸［2］。在人体中主要以三酰甘油（triacylglycerol，TAG）的形式储存［3］。研究表明，NA 与人体多种疾病有关，而人体无法合成NA，必须从食物中获取。探究NA 及其衍生物的生理功能、来源及合成途径等对现代基因工程规模化生产NA 具有重要价值。本文对NA的生物功能、生物来源、合成途径及基因工程生产NA 的研究进展进行综述，以期为将来通过转基因技术和分子育种调控NA 的生产、获得可再生的NA 资源提供一定的思路和策略。

1 NA的相关功能

NA 是一种天然的生物活性脂肪酸，最早以神经鞘脂（nervonic sphingolipids，SLs）形式被发现。早在1972 年，英国神经学家就发现NA 具有修复鲨鱼受伤脑组织的作用［4］。NA 及其衍生物存在于人体多数组织中，大脑、肝脏及肾脏中较为丰富［5］。NA 及其衍生物以自由状态或通过酰胺键与鞘氨醇碱结合形成神经酰胺、鞘脂［6］等物质参与众多生物过程［7-8］。Phung 等［9］系统总结了NA 功能及相关机制，主要包括细胞结构、信号传导、抗炎、脂质动员4 个相互关联的功能。人体缺乏NA 会引起神经系统发育异常、脱髓鞘疾病、神经退行性疾病、心脑血管疾病、免疫缺陷疾病、肿瘤及抑郁症等多种疾病，机体摄入NA 可以协调作用多个靶点，共同缓解机体症状（表1）。

NA 及其衍生物在工业上也有广泛应用，作为生产塑料、化妆品、树脂、尼龙、表面活性剂、生物燃料和润滑剂等产品的原料［32］。相较于其他工业原料，绿色及具可持续特性的NA 及其衍生物，更具有应用和推广价值。

随着社会环境的改变以及人口老龄化程度的加深，我国患心脑血管疾病、神经退行性疾病、癌症以及抑郁症的人数不断攀升。由于这类疾病无特效药，病程极长，治疗及康复过程将占用大量公共资源，成为经济和社会发展的阻碍。我国植物神经酸研究起步较晚，近年来才展现出急起直追之势。国内的研究主要聚焦于工业化提取［33］、自然资源元宝枫（Acer truncatum Bunge ）籽油的工业化生产以及微藻品种的发掘等基础研究。市场上售卖的NA 产品主要有国牡元宝枫籽油、汉林牌脑忆康胶囊和寿堂牌纳福希胶囊等，品类少且价格贵。我国亟需开发新型NA 资源，加速深层研究，更好地服务大众。

2 NA的生物来源

2.1 动物来源

发达国家最早从鲨鱼脑中提取NA［1］，但国际组织明令禁止捕获鲨鱼。近年来，在大西洋鳕、大马哈鱼以及红鲑等鱼类中发现NA 及其衍生物，但由于人类过渡捕捞和海洋环境污染，这些鱼类资源的可持续性和安全性受到威胁，限制其作为NA 来源进一步开发利用［34-35］。在其他哺乳动物的大脑中也含有神经酸，但其经济产量较低，尚未得到大规模开发应用（表 2）。

2.2 植物来源

一些植物的果实和种子油中含有丰富的NA。截至目前，在13 科31 个属的38 种植物中发现NA［49-50］，包含木本及草本两大类，其中应用较广及NA 含量较高［NA 占总脂肪酸（FA）19% 及以上］植物见表 2。

木本植株较长的生长周期在很大程度上限制其利用，故只有NA 含量高的物种才具有开发利用价值。广东和云南特有物种蒜头果果仁中含有55.7%～67% 的NA，为国家二级保护植物，无法作为NA 的主要来源［36］。元宝枫果油中含有6% 的NA，不断优化的提取技术将终产品NA 含量提高到47% 左右［37-38］。盾叶木（Macaranga adenantha）NA含量高，但分布零散［39］。故我国特有物种元宝枫凭借其较为丰富的资源，成为目前提取NA 的主要自然植物资源［37-39］。

含NA 的草本植物十字花科居多，十字花科植物较木本植物生长周期短，繁殖继代快，具有先天的开发利用优势［35］。碎米荠（Cardamine graeca）NA 含量最高，但其苛刻的生长条件限制其大规模扩繁种植［40］。智利独有的多年生草本植物旱金莲（Tropae⁃olum speciosum），其种子油NA 占总FA 的40.0%～45.4%，但种子较难获得和繁殖［41］。银扇草（Lunariaannua）是2年生草本油料作物，其种子油NA 含量相对较低且产量不稳定，无法规模化收获，同时其高达50% 的芥酸（erucic acid，EA）无法满足NA 油的相关应用要求［42］。

2.3 微生物来源

在现有报道中，天然微生物的NA 含量和滴度相对较低（表 2）。早在1986 年，Nichols 等［51］就在硅藻Nitzshia cylindrus 中发现了低含量的NA；近年来，Yuan 等［43］在华东地区发现绿色微藻Mychonastes af⁃ter HSO-3-1（M. HSO-3-1）中含NA，且具有极低的EA 含量和较高的亚麻酸（C18∶3）含量。Saadaoui等［44］在波斯湾分离得到1 株耐高温和广泛盐度的Nannochloris sp.QUCCCM31，其NA 含量占总脂质的9.97%。

除微藻外，少数真菌和细菌也具有合成NA 的能力。植物病原丝状真菌Macrophomina phaseolina 和细菌Francisella tularensis 可产生较高含量的NA，但较高的感染性限制其应用［45-46］。有学者鉴定，油丝状真菌Mortierella capitata RD000969 和Mortierellaelongata SC-208 可分别积累占总脂肪酸6.94% 及4.9% 的NA，但经发酵优化后，NA 滴度只能达186.3和123.7 mg/L，达不到工业应用程度［47-48］。

由于天然物种中动物资源的单一性和稀缺性，植物资源的长周期性和难获得性，微生物资源的低NA 含量，致使从自然资源中获取NA 无法满足市场需求，需进一步改造和筛选新的NA 来源。

3 NA的生物合成途径

NA 作为超长链脂肪酸再加上其单不饱和的特性，其生物合成主要划分为3 步［3］：在质体脂肪酸合酶复合体作用下，乙酰-CoA 从头延伸生成软脂酸-ACP 或硬脂酸-ACP；去饱和形成油酸（oleic acid，C18∶1）；在内质网脂肪酸延伸酶复合体作用下经缩合、还原、脱水、还原循环3 次延伸生成NA［52-54］（图 1）。该复合体包括3-酮酯酰-CoA 合酶（3-keto‐acyl-CoA synthase，KCS）、3-酮酯酰-CoA 还原酶（3-ketoacyl-CoA reductase，KCR）、3-羟酯酰-CoA 脱水酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrase，HCD）和羟酯酰-CoA还原酶（enoyl-CoA reductase，ECR），其中KCS 是碳链延伸过程的限速酶，结合囊的性状和大小赋予严格的底物及组织特异性，决定最终产物的碳链长度［55］。

合成的NA 经酰基转移酶作用以甘油三酯（triglycerides，TAGs）的形式储存［54-56］（图1）。值得注意的是，NA 在哺乳动物母乳中主要结合于三磷酸甘油（G3P）的sn-2 位，而在植物中主要结合sn-1 和sn-3 位［57］。

4 基因工程生产NA现状及前景

有学者利用顺-13-二十二碳烯基甲酯化学合成NA，但存在产率较低、副产物较多、制备过程资源消耗高，污染严重等问题［58］；随着基因工程以及合成生物学技术的蓬勃发展、NA 合成和组装相关基因的确定，基因工程生产NA 凭借其规模大、耗时短、资源浪费少，吸引了各国科学家的加入。

4.1 底盘选择

由于微生物具有增殖周期短、产量高、条件限制少、遗传转化便捷等特点，科学家最早开发微生物底盘来生产NA。微藻和酵母在改造项目中占据高位［59-60］。有学者在酵母中异源表达菌株Mychonas⁃tes HSO-3-1 的KCS 基因［61］以及Lunaria annua 的KCS 基因（LaKCS）［62］，转基因品系中产生 NA。夏俊杰［63］利用酿酒酵母构建了高产NA 工程菌，使得NA 产量高达到1.37%。Zhang 等［64］在Saccharomy⁃ces cerevisiae 中共表达Crambe hispanica 的ChFAE1和Lunaria annua 的 LaKCS，使得转基因株系产生5% 的NA。Wang 等［65］在产油酵母Yarrowia lipo⁃lytica 中构建出植物与非植物相结合的NA 合成通路：增加C18∶0 作为非植物途径前体的供应，同时删除了β-氧化途径；利用 NA 特异性Malania oleifera的MoLpaat 替换其内源LPAAT，并增加了辅助因子的供应，最终获得NA 含量为23.44% 菌株。

科学家在利用植物底盘生成NA 的尝试主要集中在十字花科。Huai 等［52］利用拟南芥（Arabidopsisthaliana）中单拷贝的AtKCR、AtHCD 和AtECR 组合LaKCS，辅助种子特异性启动子，在亚麻荠（Cam⁃elina sativa）中异源表达，研究了所有延长酶组分的组合效应。在AtKCR、AtHCD 以及AtECR 单独结合LaKCS 构成的3 个双基因共表达系，以及AtK⁃CR、AtHCD 和LaKCS 结合的三基因共表达系中，NA 均没有进一步增加，再次证明KCS 基因在NA 延长过程中限速酶的重要地位。Guo 等［62］将LaKCS基因转移至拟南芥以及高EA 埃塞俄比亚芥（Brassi⁃ca carinata）中表达，结果显示转基因系NA 含量较野生型分别增加30 和10 倍，转基因埃塞俄比亚芥中NA 含量更是高达30%。Taylor 等［66］在埃塞俄比亚芥中表达Cardamine graeca 的 KCS 基因（CgKCS），使得NA 比例增加到42.2%。高的NA 比例、较高的种子油含量（38%）和田间种子产量（167～200 kg/667 m2）使其成为目前所有NA 种子源中表现最好的品种［35］。

外源基因的转入可使微生物产生NA，但难免会遇到大型生物发酵设备持续的资金投入问题；相较微生物，选择繁殖快、产量高的十字花科植物生产NA，除前期开发株系需一定资本投入外，后期应用只需根据需求调整种植面积即可。

4.2 可利用基因资源

NA 天然物种蒜头果［54，67］、文冠果［68］、元宝枫［69］基因组测序的完成及KCS 基因家族的鉴定和分类，为基因的选择提供了保障。目前鉴定出的拟南芥、蒜头果、文冠果、元宝枫KCS 基因家族成员分别有FAE-like、KCS-like、FDH-like 和CER 等4 个亚族。元宝枫线粒体［70］、叶绿体［71］基因组测序的完成，进一步拓宽了可利用基因的范围。有学者将产油酵母、拟南芥、碎米芥和蒜头果的酰基转移酶序列进行比对，并对酰基转移酶编码基因进行了鉴定［54］。异源酰基转移酶在植物中表达可提高超长链脂肪酸（very long-chain fatty acids， VLCFA）在TAG 中的组装效率以及含油量［72-74］。可利用基因资源的不断丰富，促进基因工程生产NA 的进一步发展。

4.3 生产NA的植物代谢工程前景

前人已验证在植物中异源表达重组KCS 能够显著改变十字花科VLCFA 的含量。利用植物代谢工程生产NA 的研究思路还可进一步拓展，包括：提高某种超长链脂肪酸底物含量、提高脂肪酸组装效率以及含油量等［75］。同时综合考虑最终NA 产品所需的便捷性、经济性和可持续性，可优选产量大、可持续、易应用的植物种子油为NA 载体。借助前人改造十字花科生产NA 的经验，采取将KCS 基因以及TAGs 生物合成相关基因相结合的多基因策略，进一步开发十字花科油料作物生产NA 种子油有望实现既得利益最大化。以下探讨影响十字花科油料作物种子油中NA 含量的主要因素。

1）KCS 基因的选择 。KCS 作为NA 生物合成过程中的限速酶，具有严格的底物以及组织特异性，决定转基因作物中NA 的最终含量。元宝枫Chr4.2307.KCS、Chr4.2308.KCS、Chr4.2311.KCS 在NA 生成关键时期显著上调［76］；蒜头果MoKCS11对二十碳烯具有显著底物偏好性［77］，FAE-like 基因Maole004215.T1在野生酵母中表达产生C22∶0/C22∶1和C24∶0/C24∶1 等4 种新的脂肪酸［78］。

将不同的KCS 进行组合，构成代谢链，调动不同底物转化成NA；或选择底物充足的转化底盘，提高底物转化率，以突破单基因调控NA 含量增加的有限性。值得注意的是，目前普遍认为摄入EA 过多，会引起心脏疾病［79-80］。转基因植物种子中EA 含量与该品种的利用价值呈负相关，增加NA 的同时降低EA 的含量，也是未来改造的目标之一。

2）提高NA 的存储能力。不同十字花科油料作物含油量及NA 比例均有所不同，只有含油量超过10% 且NA 比例高的油料作物才具有开发利用价值［35］。故在未来改造过程中不仅要提高NA 含量还要兼顾作物含油量的提高。TAG 是种子油中的主要成分，将KCS 基因与提高TAG 含量的相关基因共表达，有助于培育高价值新品种。

①促进NA 积累。在经典的肯尼迪途径（Kennedypathway）中，GPAT、LPAAT 和DGAT 催化G3P主链上连续的酰化反应生成TAG［81-82］。在烟草以及马铃薯块茎中，利用强组成型病毒启动子CaMV-35S 表达DGAT1，导致TAG 增加，并且对植物生长没有显著的负面影响［83-84］。植物内源性酰基转移酶只能将NA 并入且不能同时并入TAG 的sn-1 或sn-3位，sn-2 位通常由16C 和18C 脂肪酸占据［50，61］，限制了NA 在植物中的含量。Zou 等［72］在高EA 油菜中表达酵母的LPAAT 基因SLC1-1，将TAG sn-2 位置上的芥酸酰比例提高到41%［73］。由此推断，TAGsn-2 位结合NA 的能力和偏好也可以通过异源表达相关的基因来调节。Wang 等［69］将来自Malania"oleifera 的MoLPAAT 在Yarrowia lipolytica 中进行表达，发现其可替换内源LPAAT 发挥功能，并表现出对包括NA 在内的超长链单不饱和脂肪酸的偏好性，使得转基因菌株NA 含量增加到17.10%。此外，Ma 等［75］通过元宝枫的加权基因共表达网络分析验证了转录因子MYB 以及bZIP 在NA 合成过程中的调控作用。

筛选DGAT 基因增加TAGs 含量，同时应用对NA 具有偏好性的内源或外源LPAAT 提高TAGsn-1、sn-2 以及sn-3 位点结合NA 的能力，辅助转录因子对NA 合成的调控，进一步设计NA 代谢路径，能够最大限度地增加NA 积累量。

②减少NA 降解。在植物中合成的脂肪酸主要通过过氧化物酶体的β-氧化途径分解代谢。Goepfert等［85］在利用拟南芥探究脂肪酸降解β-氧化途径时，发现β-氧化阻断突变体表现为TAG 分解的减少和长链酰基CoA 的积累。Xue 等［86］在利用Y. lipo⁃lytica 生产二十碳五烯酸（EPA）时发现，PEX10 基因突变会损伤过氧化物酶体的形态和完整性，原菌株β-氧化途径缺陷，导致酶体对VLCFAs 的降解能力减弱，EPA 滴度较原菌株提高2 倍。Wang 等［65］将该菌株PEX10 敲除，截断脂肪酸β-氧化降解途径，最终NA 积累量达到亲本菌株的29 倍。另有学者发现删除β-氧化途径可显著增加总脂质含量［87］。参考和拓展脂肪酸降解途径删除或截断策略，可以最大程度地减少NA 的降解。

增加NA 积累，减少NA 氧化降解，提高NA 结合效率，逐级递进式增加植物转基因品系中NA 的含量。

3）基因表达情况。

①特异性启动子应用。特异性启动子表达目的基因，实现目的基因在目标组织中的高活性而在其他组织中低活性，以减少潜在的负面影响。利用种子特异性启动子表达具有底物特异性的KCS 相关基因是生产NA 种子油的一个有效策略。种子特异性napin 启动子、种子特异性大豆glycinin-1 启动子以及大豆优速启动子均被验证能驱动KCS 基因在相应受体内表达，并增加NA 的含量［52，62，78］。

②基因拷贝数。除依托某特异性或强启动子提高基因转录表达水平外，还需考虑基因在物种内的拷贝数。Guo 等［62］发现在转入LaKCS 的转基因品系中，NA 含量与LaKCS 的拷贝数呈正相关，多拷贝株系中转录物强度更高。因此在选定基因基础上增加拷贝数，或许可以最大化提高终产物含量。

③最优基因组合。在选定目标基因的基础上，还需要考虑基因间的相互作用：相关基因结合构成的代谢链是否会产生不必要的中间产物，该产物是否对终产物的合成有负面影响，在终产物提取及利用过程中是否需要花费大量人力物力来去除，以及相关基因的表达是否影响作物自身正常生长发育。在先前的研究中，就有在拟南芥中表达LaKCS 基因，产生7.6%NA 的同时产生13.8% 的EA，而目前认为较高的EA 含量可能对人体具有负面作用，例如可能引发心脏问题［79-80］ 。因此，在后续的研究中应该斟酌该基因的使用或结合新的KCS 基因将EA 进一步利用转化为NA。

因此，未来在转基因改造过程中，要尽可能规避以上风险问题，并最大化利用特异启动子及基因自身特性，寻找最适配基因组合，增加基因拷贝数，构成NA 代谢链，缩减时间及资金成本。

4）受体选择。NA 最终的得率除由NA 比例和种子的含油量决定外，还由底盘品种的产量和抗逆性等综合指标共同决定。目前的研究主要关注提高NA 比例，甚少考虑受体自身性状对NA 获得的影响。

①受体农艺特性。NA 的最终产量由作物产量、含油量以及NA 比例共同决定。我国主要的油料作物有大豆、油菜、花生、葵花籽等，NA 在这些主要栽培油料作物中含量极低或无。其中油菜是我国第一大油料作物，属于十字花科芸苔属，年播种面积700hm2 以上，年产油达520 万t，占国产植物油总量的47%，且年产量与消费量逐年增长［88］。油菜品种的多样性、较高的含油量、较短生长周期以及高产抗逆的农艺性状，再加上成熟的遗传转化体系可为植物代谢工程生产NA 提供最基础、稳妥的保障［35］。

②受体底物含量。富含 NA 的油通常混有大量EA，考虑到 EA 对健康的影响，市场急需高 NA 低EA 的油。EA 作为NA 的直接前体物质，以高EA 油菜品种为受体，有望提高合成NA 的效率并降低EA含量，平衡营养和安全。但目前如何将尽可能多的EA 转化成NA 缺乏丰富的分子机理研究以及实验证据支持。有学者曾尝试在高EA 甘蓝型油菜表达Cg⁃KCS，但产量不容乐观，仅为1 500 kg/hm2［78］。另有学者在产油酵母Y. lipolytica 中构建NA 合成双通路：在植物途径的基础上，增加C18∶0 作为非植物途径的NA 前体［68］。今后的研究应汲取已有经验，发挥不同油菜品种的潜在价值，促进不同脂肪酸底物转化为NA，实现营养、安全双平衡。

5）生长环境与人工选择的影响。生物体的性状受到基因以及环境的共同作用。种植的时间、地理位置、水文条件等影响种子的出苗情况；生长过程中的施肥状况、人为活动、水源灌溉周期、病虫害等影响作物的生长状况［35］；收获时期的收种方式、收种时间、收种后的储存方法等影响种系的实际收获率，最终综合影响作物的产量、含油量以及脂肪酸的含量。

在保持适宜且一致的种植模式和收种方法的同时，辅之准确的人工选择，对含有优良目标性状的种系进行选择归类，逐步优化作物的目标性状。在Guo等［62］的研究中，表达LaKCS 的转基因埃塞俄比亚芥经过2 代筛选后，最佳NA 含量达到30%，达T1代转基因株系NA 含量的2 倍。逐代选择含油量及NA 含量高且EA 含量低、产量和抗逆性与野生型没有显著差异的目标植株，可使NA 最终产量最大化。

5 结语与展望

NA 及其衍生物在人体内广泛分布。作为神经纤维髓鞘的核心成分，NA 具有修复受损大脑神经纤维、促进神经细胞再生的功能；作为膜结构的重要成分，NA 能够调节胆固醇分布，维持体内膜平衡；作为储存脂质，NA 可优先分解氧化，提供能量，支持人体生命活动。缺乏NA 会导致多种疾病。NA 及其衍生物的酯化形式可作为药物成分和膳食补充剂的原料，以生物递质、前药、奶粉、食用油、饮料、口服乳剂和胶囊等形式应用于日常生活和医疗保健。

我国NA 目前主要有2 种来源。一种是通过蒜头果、元宝枫等植物直接提取，但可利用植物生长周期长、繁殖速度慢、采集收种困难。另一种是通过基因工程改造现有物种合成NA，但以微生物为底盘生产NA，难以避免大量养殖微藻所带来的环境污染，且提纯设备和工艺复杂，需要持续的资金支持；而以植物为底盘生产NA，目前已表现出较为理想的NA产量，且在生产体系成熟后，种植面积为唯一限制因素。相较而言，植物基因工程生产NA 具有更高的应用潜力。

在先前的研究中主要聚焦脂肪酸延长步骤中限速酶基因KCS 的表达调控，忽略了NA 在内的油脂合成是一个多基因协同作用的复杂的代谢过程，NA 的最终得率由作物本身产量、含油量和NA 比例等多因素共同决定。本文对已有研究进展进行分析比较，将植物基因工程生产NA 的改造重点放在十字花科油料作物油菜上，希望借助其成熟的研究体系，以及高产抗逆，高含油量、易遗传转化等优质农艺性状，在保障产量的基础上再根据VLCFA 合成规律，采取多基因策略，组合包括调动EA 在内的各底物转化为NA 的KCS 基因，负责提高含油量和将NA 组装到TAG 各个位置上的相关基因；同时借助种子特异性启动子，将易应用的种子油作为最终的NA 载体。以期为将来通过转基因技术和分子育种调控NA 的生产，获得可再生的NA 资源提供一定的思路和策略，让NA 更好地惠及大众、造福人类。

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（责任编辑：张志钰）