SCF泛素连接酶的体外泛素化体系构建与检测

摘要 为研究蛋白质的体外泛素化过程，利用大肠杆菌表达系统异源表达和纯化APPBP1/UBA3（ E1）、UBC12 （E2）、Cullin1-Rbx1 （E3）和Nedd8 （neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein8）蛋白，制备FITC-Cysteine 绿色荧光素标记的泛素Ub（Ubiquitin），构建了SCF 泛素连接酶的体外泛素化体系，同时实现快速检测SCF 泛素连接酶中Cullin1 蛋白的自泛素化修饰。结果表明，建立的体外SCF E3 自泛素化活性反应体系具有较高的可操作性和便利性。

关键词 SCF 泛素连接酶； 泛素化修饰； Cullin1 蛋白； 荧光标记

中图分类号 Q814 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2024）02-0273-07

SCF 复合物（multisubunit SKP1/Cullin1/Fbox，SCF）是一种被广泛研究的多亚基E3 泛素连接酶，该复合物是最大的一个泛素化连接酶蛋白家族，由SKP1、Cullin1 和F-box 蛋白组成，这些蛋白质相互连接并执行不同的功能。人类、秀丽隐杆线虫和植物中分别有约70、300 和1 000 种SCF 泛素连接酶［1］。SCF 泛素连接酶在调节植物生长发育和生理机制等方面起着关键的作用，目前已有较多文献报道了它参与植物次生代谢、植物胁迫、植物激素信号传导和植物光形态建成等过程［2-5］。当植物面临病原体的威胁时，利用SCF 泛素连接酶复合物降解其自身防御反应的负调节蛋白或者病原体的蛋白质，从而抑制病原体入侵［6-7］。SCF E3 连接酶在几种关键植物激素的感知和信号转导中起着重要作用，包括生长素、茉莉酸、三萜内酯、赤霉素和乙烯。例如，在水稻的独脚金内酯（strigolactone， SL）信号通路中，稳定的抑制显性矮杆突变体蛋白DWARF53（D53）及其同系物在缺少SLs 的情况下可以募集植物辅抑制因子TPL/TPR 蛋白并抑制下游反应，在SL 存在的情况下，独角金内酯受体DWARF14（D14）蛋白感知SLs 信号，触发SCF 泛素连接酶介导D53 蛋白泛素化，随后被蛋白酶体系统降解，解除对下游反应的抑制［8-10］。

蛋白质合成和降解之间的平衡对细胞生存和发育至关重要［11-12］。蛋白质降解有2 种主要途径：自噬和泛素蛋白酶体系统（autophagy and ubiquitin-proteasomesystem）［13］。自噬功能以溶酶体依赖的方式降解细胞中过量或异常的蛋白质，而泛素蛋白酶体系统以蛋白酶体依赖的方式特异性泛素化并降解错误折叠和受损的蛋白质。泛素蛋白酶体系统在真核生物中高度保守，对许多生物过程有重要作用。ATP依赖的泛素偶联途径包括泛素激活酶（ubiquitin activatingenzyme， E1）、泛素偶联酶（ubiquitin conjugatingenzyme， E2）和泛素蛋白连接酶（ubiquitin ligase，E3），然后通过26S 对蛋白进行降解［14-16］。在所有真核生物中，SCF 泛素连接酶具有相似的模块化结构，Cullin 蛋白（植物中的Cullin1、Cullin3 和Cullin4）具有一个细长支架结构，在其一端与催化亚基RBX1 相互作用，在另一端与底物受体亚基相互作用［17-19］。SCF E3 复合物的关键特征是Cullin 蛋白C 末端一个保守的赖氨酸被Nedd8（neural precursor cell expresseddevelopmentally down-regulated protein 8）共价修饰。SCF 复合物的形成和激活是一个受调控的过程，首先SCF 复合物中的Cullin 蛋白被Ned‐dylation 修饰，被修饰后SCF E3 复合物才能被激活［20-21］。与泛素化过程一样，Neddylation8 修饰与Cullin 蛋白的结合是通过E1（APPBP1/UBA3）、E2（UBC12）和E3（Cullin-Rbx）多酶级联来实现的［22］。遗传学研究表明，Neddylation8 修饰对体内SCF E3复合物的活性有重要影响［22-24］。

建立体外泛素化修饰检测系统对于研究E3 泛素连接酶在生长发育中的分子机制十分重要。然而，由于多亚基SCF E3 泛素连接酶的组成比较复杂，获得具有活性的E3 复合体组分存在较大困难，迄今为止，多亚基SCF E3 泛素连接酶的体外活性检测体系尚不成熟。本研究构建SCF 泛素连接酶的体外泛素化体系，实现快速检测SCF 泛素连接酶中Cullin1 蛋白的自泛素化修饰，旨在为研究E3 连接酶的机制提供基础平台。