小菜蛾幼虫生防菌株毒力测定及产毒条件优化

关键词：小菜蛾幼虫；生防菌株筛选；毒力测定；粉红粘帚霉；产毒条件优化

小菜蛾（Plutella xylostellaL．）隶属于鳞翅目菜蛾科菜蛾属，又称小青虫、两头尖，为害白菜、萝卜等十字花科蔬菜最为严重。它啃食蔬菜叶片，导致叶片变成网状，品质下降，销售受到影响。小菜蛾一直在我国南方省份严重发生，导致许多蔬菜作物失去原有价值，一些地区甚至颗粒无收，种植户们苦不堪言，已成为一种亟待防治的主要害虫之一。

目前，已从化学防治、物理防治、生物防治以及一些农业防治等领域对小菜蛾的防治做出研究，其中生物防治是较为高效且对人畜低毒或无毒的防治方法。有研究表明，蜡蚧轮枝菌（Ver-ticilliu.m lecanii）、球孢白僵菌（Beauveria bassi-ana）及金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌剂的10倍稀释液对小菜蛾都具有很好的防治效果。但关于粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）、淡紫拟青霉（Purpureocillium lilacinum）、02号生赤壳属（Bionectria sp.）菌株防治小菜蛾的研究还未见报道。粉红粘帚霉作为一种在世界范围内广泛分布的丝状真菌，具有很高的生防潜力。它是自然界中一类重要的寄生真菌，可寄生于植物、昆虫和线虫活体内，也是一种重要的重寄生菌，除了用于防治虫害外，还可用于防治病害且防治效果较好。芦俊佳等曾对粉红粘帚霉防治楚雄腮扁叶蜂幼虫进行过研究，发现其具有较好的防治效果。同时，也有一些研究表明，粉红粘帚霉对植物生长具有促进作用。淡紫拟青霉是很多植物寄生线虫的重要天敌，是一种极具推广潜力的生防菌和功能菌。孙漫红等曾报道过淡紫拟青霉M-14具有很强的杀线虫活性。Lopez等通过试验发现淡紫拟青霉对棉花蚜虫有较强防效。02号生赤壳属菌株首次被发现是在对红豆杉（Taxus chinensis var. maLrez）内生真菌的研究中，被归类为生赤壳科，一系列抑菌试验后发现并证明其代谢产物具有明显的抗菌作用。

真菌的产毒与培养环境息息相关，比如培养基类型、培养基pH值、培养时间、光照条件、振荡培养条件等，对培养条件进行优化有利于生防真菌的进一步开发利用和害虫防治。本研究选用粉红粘帚霉、淡紫拟青霉、02号生赤壳属菌株对小菜蛾幼虫进行喷雾浸染，首先筛选出对小菜蛾生防效果较好的高毒力菌株，继而测定其对小菜蛾的半致死浓度（LC50）和半致死时间（LT50），优化其产毒条件，以期为小菜蛾的生物防治提供新的微生物资源，为高毒力菌株的开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株粉红粘帚霉SWFUYOO、02号生赤壳属菌株SWFUY02、淡紫拟青霉SWFUY08来源于云南省森林灾害预警与控制重点实验室。

1.1.2供试虫源3龄小菜蛾幼虫购于济源白云实业有限公司。

1.1.3仪器与试剂TGL-16G型台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品：GXM-358A型光照培养箱，宁波江南仪器厂产品：XB-K-25型血球计数板，上海求精生化试剂仪器有限公司产品；MQW-63R型振荡培养箱，上海曼泉仪器有限公司产品。其他试剂均为分析纯。

1.1.4培养基马铃薯葡萄糖琼脂（potato dex-trose agar，PDA）培养基：葡萄糖20g，琼脂粉20g，马铃薯200g，蒸馏水1000mL。马铃薯蔗糖培养基（potato sucrose agar，PSA）：蔗糖20g，琼脂粉20g，马铃薯200g，蒸馏水1000mL。察氏液体培养基（Czapek）：KN03 2g，KCl0.5g，FeS040.01g，K2 HP041g．MgS04.7H2 00.5g，蒸馏水1000mL。萨氏葡萄糖琼脂酵母膏（Sachs dex-trose agar yeast，SDAY）：酵母浸粉20g，葡萄糖40g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL。

1.2试验设计及方法

本试验于2023年2月在西南林业大学园林园艺学院实验室与云南省森林灾害预警与控制重点实验室进行。

1.2.1冻存菌株活化培养活化培养所用培养基为PDA培养基。将冻存的粉红粘帚霉、02号生赤壳属、淡紫拟青霉进行活化，每种菌株活化30皿，恒温恒湿培养箱中培养15～30d待用。

1.2.2孢子悬浮液制备取培养15～30d且长满菌丝的培养皿，用含吐温80的无菌水进行洗脱，多次搅拌，过滤菌丝得到孢子悬浮液，将三种菌株孢子悬浮液均通过16格×25格血球计数板计数确定孢子浓度为1.0x108个孢子/mL。计算公式为：

孢子浓度（个/mL）=每小方格中孢子平均数x400x104×稀释倍数。

1.2.3生防菌筛选采用喷雾法进行。设置粉红粘帚霉、淡紫拟青霉、02号生赤壳属菌株为试验组，以无菌水为对照组，每组重复3次，每重复20头3龄小菜蛾幼虫。小菜蛾幼虫先用无菌水喷雾处理消毒，处理后吸干水分，然后用三种菌株的孢子悬浮液（1.0x108个孢子/mL）对小菜蛾幼虫进行喷雾处理，将处理后的小菜蛾幼虫连同蔬菜叶片一起放入垫有湿棉花和用无菌水湿润滤纸的培养皿中，用透明保鲜膜封闭培养皿后再在透明膜上用针扎70个小孔。之后三种菌株分别做好标记，对照组编号为CK，放人培养箱中恒温恒湿培养，每隔6h观察一次，记录死亡虫数并计算死亡率。

死亡率（%）=死亡虫数／试验总虫数×100；

校正死亡率（%）=（试验组死亡率一对照组死亡率）／（1-对照组死亡率）×100。

死亡判定标准：用细毛笔轻触小菜蛾腹部，不动者视为死亡。

观察到部分死亡小菜蛾幼虫尸体上长出菌丝后，挑出菌丝接到新的培养基上，置于恒温恒湿培养箱中培养7～10d．观察新长出菌株的形态特征，并与浸染生防菌株的形态特征进行比较，确定小菜蛾幼虫死因是生防菌株浸染所致。

1.3高毒力菌株毒力测定

对预先培养的生长良好的高毒力菌株进行洗脱，确定孢子悬浮液浓度。设置测定半致死浓度的孢子悬浮液浓度梯度为1.0x104、1.0x105、1.0x106、1.0x107、1.0x108个孢子/mL。测定半致死时间的孢子悬浮液浓度为1.0x108个孢子/mL。制备好的孢子悬浮液用1.2.3的方法进行处理，并观察记录数据。

1.4高毒力菌株产毒条件优化

1.4.1不同培养基对高毒力菌株产毒的影响选用不加琼脂的PDA培养基（以下用PDB表不）、PSA培养基、SDAY培养基、Czapek液体培养基进行测定。挑取3块5 mm的高毒力菌株菌饼放于配制好的培养基中，于黑暗条件下28℃、180r/min摇床中培养，7d后通过4层纱布和两层滤纸过滤，8000r/min离心10min，上清液即为无菌丝的粗毒素。将提取出的粗毒素用喷雾法处理小菜蛾幼虫，方法与1.2.3中的一致，每6h记录一次小菜蛾幼虫死亡数，计算校正死亡率。培养观察期间分别以对应的粗毒素保湿，对照采用无菌水处理。

1.4.2不同初始pH值对高毒力菌株产毒的影响

设置pH值为5、6、7、8、9共5个处理，以PDB培养基为基础培养基培养7d后提取粗毒素，按1.4.1的方法进行提取和处理小菜蛾幼虫，并记录数据。

1.4.3不同培养时间对高毒力菌株产毒的影响

设置3、5、7、9d和11d共5个培养日寸间，以PDB培养基为基础培养基，分别于不同培养时间提取粗毒素，按1.4.1的方法进行提取和处理小菜蛾幼虫，并记录数据。

1.5数据处理与分析

试验数据使用Microsoft Excel进行统计处理并作图，用SPSS 26.0软件中Duncan's新复极差法进行差异显著性比较（Plt;0.05）。

2结果与分析

2.1生防菌株筛选

死亡小菜蛾幼虫体表菌丝回接培养7～10d后观察形态，发现从幼虫体表长出的菌株形态和生长状况与接种的菌株一致，表明小菜蛾幼虫死因是受到接种菌株的浸染。小菜蛾幼虫接种不同菌株的校正死亡率如图1所示，粉红粘帚霉SWFUYOO、02号生赤壳属菌株SWFUY02、淡紫拟青霉SWFUY08对小菜蛾幼虫均有致死作用，60h时累计校正死亡率分别为98.04%、47.06%和54.90%。综合比较三种生防菌株对小菜蛾幼虫的浸染致死率，发现粉红粘帚霉对小菜蛾幼虫的浸染致死作用较强。因此，选取粉红粘帚霉进行后续的毒力测定和产毒条件优化试验。

2.2高毒力菌株毒力测定

高毒力菌株粉红粘帚霉SWFUYOO对小菜蛾幼虫的致死情况如图2所示。接种60h时，孢子悬浮液浓度为1.0x108个孢子/mL日寸小菜蛾幼虫校正死亡率可达98%以上，浓度为1.0x104个孢子/mL时校正死亡率为63.33%。可知，小菜蛾幼虫死亡率随菌株孢子悬浮液浓度的增加而逐渐增高，致死率与孢子悬浮液浓度呈正相关。

选取孢子浓度为1.0x108个孢子/mL试验组数据（表1）计算得出，粉红粘帚霉对小菜蛾幼虫的半致死时间LT50为30.88h。根据显著性最高时间段54h时小菜蛾幼虫死亡率与孢子悬浮液浓度之间的回归关系可得，粉红粘帚霉对小菜蛾幼虫的半致死浓度LC50为4.365x104个孢子/mL（表2）。

2.3高毒力菌株产毒条件优化

2.3.1不同培养基对高毒力菌株产毒的影响四种培养基培养的粉红粘帚霉毒素发酵滤液——粗毒素对小菜蛾幼虫的致死力存在一定的差异，但均有毒杀作用（图3）。其中，SDAY和PDB培养基粗毒素的毒杀作用较强，其次为PSA，Czapek的毒杀作用最弱。可见，四种培养基中SDAY和PDB较有利于粉红粘帚霉产毒。

2.3.2不同初始pH值对高毒力菌株产毒的影响

以PDB为基础培养基，设置5、6、7、8、9共5个pH值梯度发酵培养并制备粉红粘帚霉粗毒素。结果（图4）显示，各粗毒素对小菜蛾幼虫都具有毒杀作用，但致死力存在显著差异。粉红粘帚霉粗毒素毒性随pH值增大呈先增强后减弱趋势，初始pH值为6时粗毒素毒杀作用最强，据此确定其最适产毒pH值为6。

2.3.3不同培养时间对高毒力菌株产毒的影响

以PDB为基础培养基，设置3、5、7、9d和11d共5个培养时间梯度发酵培养并制备粉红粘帚霉粗毒素。结果（图5）显示，各粗毒素对小菜蛾幼虫都有毒性，且随培养时间延长呈先增强后减弱趋势，以7d时毒力最强，9d和11d时减弱且两者间差异不显著。其原因可能是，粉红粘帚霉在培养过程中逐渐分泌毒素，培养后期培养基中的营养物质减少，粉红粘帚霉生长减缓，分泌的毒素随之减少。据此，确定粉红粘帚霉产毒的最适培养时间为7d。

3讨论与结论

本研究中，供试三种生防菌株粉红粘帚霉、淡紫拟青霉、02号生赤壳属对小菜蛾幼虫都具有毒杀作用。其中，粉红粘帚霉对小菜蛾幼虫的生防毒力最强，接种36h时小菜蛾幼虫校正死亡率为58.37%，接种60h时为98.04%：淡紫拟青霉次之；生赤壳属最弱。

半致死时间LT50和半致死浓度LC50是衡量生防菌株对寄主毒力的重要指标。甄伟用浓度为107个孢子/mL的球孢白僵菌[Beauveria bassi-ana（Balsamo）

Vuillemin]处理小菜蛾幼虫，6d时的校正死亡率为87.14%。刘曼等用贵州麻江白僵菌（Beauveria majiangensis）MJ1015菌株对三种金龟子幼虫的毒力进行测定发现，其LC50分别为4.75x106、1.29x107、2.78x107个孢子/mL，LT50范围在3.86～13.3d之间。周立等筛选出两株对斜纹夜蛾有高致病力的球孢白僵菌，其LT50分别为5.01d和5.98d，LC50分别为3.29×107、8.09x107个孢子/mL。本研究中，粉红粘帚霉对小菜蛾幼虫的LT50为30.88h，LC50为4.365×104个孢子/mL。同比可见，粉红粘帚霉对小菜蛾幼虫具有毒力高、致病速度快等特点，可作为小菜蛾生物防治的优良微生物资源，下一步可对其进行田间防效试验。

粉红粘帚霉是自然界中一类重要的寄生菌，可寄生于植物、昆虫和线虫活体内，也是一种重要的重寄生菌，除了防治虫害，还可用于防治病害。许多研究表明，粉红粘帚霉对草莓、番茄和玫瑰的灰霉病具有很好的防治效果。杨蕊等研究了粉红粘帚霉对玉米茎基腐病的抑菌防病作用，发现其对玉米茎基腐病具有生防潜力，其孢子液还能在一定程度上提高种子的发芽率和单株鲜重。还有研究表明，粉红粘帚霉和淡紫拟青霉具有促进植物生长、产生多种功能酶和降解农药等作用，前者还有望被用于生产生物燃料，具有很大的开发前景。本试验结果显示，粉红粘帚霉的最适产毒培养基为SDAY、PDB，最适产毒pH值为6，最适产毒培养时间为7d。本研究得出的粉红粘帚霉的产毒优化条件，可为其在生防上进～步开发利用提供理论依据。但本试验只选取了培养时间、初始pH值和培养基3个条件，更多条件的优化还有待进行：且本试验只研究了粉红粘帚霉对小菜蛾幼虫的毒杀作用，它在其他害虫上的毒力情况还有待挖掘，后续可对其生防价值展开进一步研究。