广热带睡莲的挥发态气味物质检测及优良芳香品种筛选

关键词 睡莲； 挥发物； 气味活性成分； HS-SPME-GC-MS； 品种筛选

中图分类号 S682.32 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2024）03-0230-10

中国芳香植物种质资源丰富，应用历史悠久［1］。近年来，芳香植物的产业价值凸显［2］，中国芳香保健产业仅精油市场份额就达57.11 亿元，可供挖掘的市场空间达500 亿元［3］。各类芳香物质如紫罗兰酮［4］、芳樟醇及其氧化物［5］、金合欢烯［6-7］等对人体生理和心理健康效用已被逐步验证，并在康养产业中推广应用。值得一提的是，梅花［8］、桂花［9］、菊花［10-11］等中国传统芳香植物的研究不断深化，为其康养功效发掘和应用形式创新奠定了理论基础。

芳香植物品种间的香气物质差异显著，优良品种筛选是开展芳香产品研发的前提。如在梅花（Prunus mume）的研究中发现肉桂醇是其重要香气成分之一，不同品种肉桂醇脱氢酶活性差异导致其合成量差异，进而导致梅花品种间的香气差异［8］。朱琳琳等［9］研究表明，丹桂品种群富含芳樟醇及其氧化物，呈现花香、木香，而金桂、银桂品种群富含β-紫罗兰酮、α-紫罗兰酮，呈现甜香；特色品种‘日香桂’不仅富含β-紫罗兰酮、γ-癸内酯和芳樟醇等香气成分，且花期长、花量大，是优良的加工品种。依兰（Cananga odorata）是重要的热带香料作物，科摩罗依兰香气成分以酯类为主，而斯里兰卡依兰以烯烃类物质为主，适合不同类型依兰精油产品的开发［12］。

植物合成的芳香物质主要以挥发态、游离态和糖苷态3 种形式存在，其中挥发态香气物质分子质量小、挥发性强，可以为人的嗅觉直接感知，是决定香味品质的关键因素［13］；游离态与糖苷态香气物质则储存在植物组织内，部分香气物质可与挥发态香气物质相互转化，是加工产品的重要组分［14-15］。在挥发态香气物质中，仅有部分香气活性物质可被人嗅闻感知，他们在决定芳香植物的香型和香味浓郁度方面发挥重要作用［16］。气味活性值（odor activityvalue， OAV）是气味物质含量与气味感知阈值的比值，是衡量气味活性物质感知度的关键指标。通常收稿认为OAV 值大于1 的香气物质对嗅觉感官有贡献，属于特征香气物质［17］。

睡莲为睡莲科（Nymphaeaceae）睡莲属（Nym⁃phaea）植物，花色丰富，花香宜人，是少有的芳香水生植物［18］。睡莲早在3 000 多年前就被作为芳香圣品应用于古埃及的皇家园林和宗教活动［19］，我国新疆有将雪白睡莲入药的传统，是一味重要的维吾尔族药材［20］。根据产地和生物学特性差异分类，睡莲属包括新热带睡莲（Hydrocallis）、古热带睡莲（Lotos）、广热带睡莲（Brachyceras）、澳大利亚睡莲（Anec⁃phya）、广温带睡莲（Nymphaea）5 个亚属［20］。其中新热带亚属和古热带亚属为夜开型，园林应用受到制约；澳洲睡莲品种较少且养护难度较高，推广程度低；广温带亚属和广热带亚属品种具有易繁殖、花量大、花色丰富、养护简易等优点，是目前市场主推品种。前人研究表明，睡莲品种间气味物质差异较大，热带睡莲挥发物种类与含量均显著多于耐寒睡莲［21-22］，在睡莲花茶中也呈现相似的规律［23］。睡莲挥发态成分中烯烃、烷烃种类较多，占比分别达到30.36%、17.86%。乙酸苄酯、顺式-罗勒烯、苯甲醇、金合欢烯等萜类、脂肪酸衍生物、苯环类化合物是睡莲中的主要香气成分［24］。前期研究主要集中在睡莲挥发物的种类鉴定和含量检测，基于挥发物检测进行优良品种筛选的工作尚未开展。同时，睡莲挥发物中含有大量不具备气味特征的烷烃类物质，这类非气味活性物质对睡莲香气构成相关研究存在一定干扰。通过OAV 值计算进行气味活性物质筛选是植物香气、食品风味研究的有效手段。本研究通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术（headspacesolid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPEM-GC-MS）［25］对30个广热带睡莲主栽品种的挥发态成分进行检测，采用内标法进行准确定量，并根据OAV 值解析睡莲特征气味成分，筛选优良芳香品种，以期为睡莲的芳香产业化应用提供基础数据，为睡莲香氛产品的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试材及取样

30 个品种睡莲花试验材料（图1）定植于浙江人文园林股份有限公司杭州睡莲基地，采用盆栽沉水法种植，株行距3 m，水深70 cm。2022 年10 月10 日至17 日11：00 至13：00 采集首日开放、柱头液尚未干涸的整花，每个品种取5 朵，液氮速冻后置于―80 ℃超低温冰箱保存。取花朵质量、花径一致的3 朵冻存样品在液氮冷冻下混合研磨成粉末，取0.5 g 混合均匀的粉末加入到20 mL 顶空瓶中，采用甲基叔丁基醚（MTBE，Mreda，USA）稀释100 倍的壬酸甲酯（Sigma，USA）作为内标，终质量浓度为8.75 μg/mL。取2 μL 加入到顶空瓶壁，密封平衡10 min，55 ℃水浴萃取30 min 上样，3 次生物学重复。进样口温度为230 ℃，解吸附时间为5 min。

1.2 检测条件

采用DB-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm，Themo Scientific，Bellefonte，PA，USA），载气为高纯氦气（99.999%），分流比50∶1，流速为1 mL/min。离子源和进样口的温度分别为280 ℃和230 ℃，传输线的温度为250 ℃。色谱条件：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min 速率升温至120 ℃并保留2 min，以3 ℃/min速率升温至160 ℃并保留2 min，以5 ℃/min 速率升温至200 ℃并保留4 min。质谱条件：EI（电子轰击）离子源，电子轰击能量70 eV，正离子扫描模式，质量扫描范围 m/z 40～450 amu。

1.3 物质含量测定指标

GC-MS 原始数据用Xcalibur 软件处理并导出。在相同升温程序下用正构烷烃标准样品（C8～C30）计算得到的科瓦茨保留指数（‘Kovats’ retention index，RI）。挥发物鉴定基于NIST 质谱数据库（NIST 2017）结合RI 进行定性。采用内标定量法，计算公式如下：

各组分含量=各组分峰面积／内标物峰面积×内标物含量／样品量

1.4 香气活性成分分析

OAV 是客观估计气味物质对样品整体气味贡献程度的方法，OAV 值是气味物质在样品气味中的浓度（concentration，C）与其阈值（odor threshold，OT）的比值。当OAVgt;1 时，该气味物质对整体气味具有贡献作用，OAV 值越大，对样品整体气味的贡献度越高。

1.5 数据处理

采用 SPSS 软件的单因素方差分析（one-wayANOVA）统计品种间的数据差异，热图和柱状图分别由TBtools 和Origin2021 绘制。

2 结果与分析

2.1 不同广热带睡莲品种的挥发态物质的定性和定量分析

通过HS-SPME-GC-MS 技术进行挥发物检测，根据保留时间和保留指数进行物质鉴定。在30 个广热带睡莲品种中共检测出7 类60 种挥发态成分（表1），包括萜类22 种、烷烃10 种、醛类8 种、酯类6 种、烯烃类5 种、芳香族5 种、醇类4 种。所有品种共有的挥发物为十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十九烷、6，9-十七碳二烯。此外，2-己烯醛、苯甲醇、反式-α-香柠檬烯、金合欢烯、β-倍半水芹烯也在多数品种中检出（27 个及以上品种）。部分品种含有特殊物质，如十一烷、γ-木犀烯仅在‘粉蓝星’中检出，十五烯仅在‘蓝星’中检出。

由图2A 可知，30 个广热带睡莲品种的挥发物含量存在明显差异，其中‘粉钻’挥发物总含量最高（2 308.63 ng/g），是含量最低的‘紫外线’品种（23.80ng/g）的49.12 倍。挥发物含量较高的品种（gt;1 000ng/g）有‘粉钻’‘鲁比’‘蓝鸟’等9 个品种；‘紫乔伊’‘紫外线’‘狐火’‘银河系’4 个大型蓝紫色重瓣品种挥发物含量最低。由图2B 可知，30 个广热带睡莲品种平均检出28 种挥发物，‘鲁比’挥发物种类丰富度最高，达到35 种，‘狐火’挥发物种类较少，仅15 种。

由图3 可知，烷烃、烯烃、萜类化合物是所有品种中含量相对丰富的种类，其中烷烃占比最高，平均可达38.69%，但烷烃、烯烃类物质不具有气味特征或微具气味的部分物质香味阈值极高，因此这2 类物质并不是睡莲的特征气味物质。萜类化合物虽然相对含量偏低，但多数物质气味阈值低，且具有浓郁而独特的芳香［26］，是广热带睡莲品种主要贡献成分。由表1可知，本研究在睡莲不同品种中共检测出萜类化合物22 种（表1），占全部物质种类的1/3 以上。其中，金合欢烯（平均含量111.00 ng/g）、顺式-β-金合欢烯（平均含量18.98 ng/g）、β-倍半水芹烯（平均含量35.54 ng/g）、反式-α-香柠檬烯（平均含量19.60 ng/g）、姜烯（平均含量10.9 ng/g）等含量较高，且在大多数品种中广泛存在。α-蒎烯、胡萝卜烯、γ-木犀烯仅在少数品种中检测到。由图3 可知，‘粉钻’较其他品种含有更为丰富的萜类化合物，约含有760.23 ng/g，占其挥发物总含量1/3 以上。

2.2 不同广热带睡莲品种香气活性成分分析及优良芳香品种筛选

为明确广热带睡莲的特征气味物质，进一步计算气味活性值，共筛选获得19 个气味活性物质（表2），包括8 种萜类、6 种醛类、3 种醇类和2 种酯类化合物。其中OAV 值大于1 的特征气味物质有4 种，从高到低依次为β-紫罗兰酮、反式-β-紫罗兰酮、α-紫罗兰酮和金合欢烯。其中，α-紫罗兰酮在25 个品种中均有检测到，金合欢烯在28 个品种中检测到，是多数睡莲品种的主要气味贡献物质。紫罗兰酮类物质呈现甜香、木香，而金合欢烯呈现苹果香及典型的花香，因此睡莲总体呈现淡雅的甜香特征。此外，反式-2-癸烯醛（柑橘香）、苯乙醛（果香）、二氢-β-紫罗兰酮（甜香、木香）、辛醛（柑橘香）、α-蒎烯（草香）的平均OAV 值小于1，但在部分品种中有气味贡献。挥发物中含量较高的烷烃、烯烃类化合物由于缺乏气味特征或气味阈值较高，对睡莲香气的贡献度极低。

气味物质的种类和含量决定了睡莲的香气类型和香气浓郁程度。通过OAV 值计算，α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、反式-β-紫罗兰酮和金合欢烯被筛选为主要的气味贡献成分。通过比较，筛选以上4 种物质OAV 值相对较高的品种，定义为优良的芳香睡莲品种。选取每种物质含量前3 名的品种进行比较分析，结果如图4 所示，‘卡拉阳光’有3 种物质的OAV 值较高，总体香气浓郁程度相比其他品种更为突出。‘黄金国’‘林赛伍德’‘巴拿马太平洋’β-紫罗兰酮或反式-β-紫罗兰酮OAV 值高，具有较为明显的甜香特征。‘粉钻’所含金合欢烯OAV 值在所有品种中最大，相对其他品种具有更加明显的苹果和花瓣的香气。金合欢烯是睡莲精油中含量较高的主要成分之一。‘粉钻’‘卡拉阳光’‘蓝鸟’3 个品种的金合欢烯含量均大于200 ng/g，相对其他品种较为突出，是用于精油提取的潜在优良品种。

3 讨论

睡莲是优良的水生芳香植物，既可用于芳香水景营建，也是花茶、精油、纯露等新兴产品的主要原料。睡莲精油具有抗菌、抗氧化的功效，在芳香疗法中极具应用潜力［27-28］。与玫瑰、薰衣草、薄荷等常见的芳香植物相比，睡莲的芳香研究基础薄弱，优良品种的培育和筛选刚刚起步，极大制约了睡莲香氛产品的开发。

本研究以香味浓郁、栽培广泛的广热带睡莲亚属不同品种为材料，采用HS-SPME-GC-MS 技术检测鉴定出60 种挥发物，其中十五烷、6，9-十七碳二烯、金合欢烯等含量较高，是睡莲的主要挥发物成分，与袁茹玉［21］、苏群等［22］采用顶空固相微萃取实验结果一致性较高。黄秋伟等［29］对二氧化碳超临界萃取的睡莲精油进行检测，结果也显示十五烷、6，9-十七碳二烯、金合欢烯是睡莲精油的主要成分。

通过计算OAV 值，本研究明确了睡莲的特征气味物质包括α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、反式-β-紫罗兰酮和金合欢烯。紫罗兰酮类物质OAV 值在桂花［9］、玫瑰［30］中分别高达2 222 857、4 942，是这类浓香型花卉的主要香气活性物质之一。与浓香型花卉相比，睡莲中的气味活性成分种类、含量均相对较少，OAV 值更低，因此睡莲的总体香气特征偏于温和。同时，OAV 值显示，乙酸苄酯（茉莉香味）、苯甲醇（清香）、苯甲醛（苦杏仁、坚果、樱桃的香味）等前人研究鉴定的睡莲香气物质［21-22］在本试验中香气活性值过低，可能对睡莲香气产生贡献较小。

本研究通过OAV 值比较品种间差异，筛选出‘卡拉阳光’‘粉钻’‘鲁比’‘蓝鸟’‘黄金国’5 个优良芳香品种。其中‘卡拉阳光’气味活性成分含量高，香气浓郁；‘鲁比’‘蓝鸟’‘黄金国’3 个品种紫罗兰酮类物质丰富，甜香特征明显；‘粉钻’‘卡拉阳光’‘蓝鸟’3 个品种金合欢烯含量相对较高，为精油提取的优良品种。由于本研究采样量较大，采用了低温冷冻法保存样品，样品香气物质可能存在损失，导致部分香气活性物质OAV 值偏低，影响睡莲香气活性物质的鉴别，后续在条件许可的情况下可采用鲜样和精油进一步检测鉴定。此外，采用顶空固相微萃取技术对睡莲的主要特征香气物质进行鉴定存在一定的局限性，后续可以通过GC-O 嗅辨、香气重构与缺失等方法进行验证，获取更精确的睡莲香气构成数据。

（责任编辑：葛晓霞）