脂溶性贝类毒素检测技术研究进展

摘 要：脂溶性贝类毒素是一类在贝类脂肪组织中富集，具有热稳定性，易溶于有机溶剂的毒素。由于其具有脂溶性特征，所以易在生物体中蓄积，且不易被代谢和破坏，会给消费者带来潜在危害。因此，高效、准确地检测这类毒素，对保证贝类食用安全是十分必要的。本文对脂溶性贝类毒素常用的检测技术进行了综述和对比评估，旨在发现更高效、灵敏和准确的检测方法，为脂溶性贝类毒素检测技术的改良和创新提供支撑和借鉴。

关键词：脂溶性贝类毒素；检测技术；贝类

Research Progress on Detection Techniques for Lipophilic Shellfish Toxins

JIANG Diyao1，2， WU Xiaoxiao1，2， XU Jingjing1，2

（1.Nanjing Institute of Product Quality Inspection （Nanjing Institute of Quality Development and Advanced Technology Application）， Nanjing 210019， China;"2.Key Laboratory of Biotoxin Analysis amp; Assessment for State Market Regulation， Nanjing 210019， China）

Abstract： Lipophilic shellfish toxins are a class of shellfish toxins that accumulate in the adipose tissue of shellfish and exhibit thermal stability and solubility in organic solvents. Due to its lipophilic properties， it is prone to accumulate in living organisms and is not easily metabolized or destroyed， thereby posing potential risks to consumers. Therefore， efficient and accurate detection of such toxins is essential to ensure the safety of shellfish consumption. This paper provides a review and comparative evaluation of commonly used detection techniques for lipophilic shellfish toxins， aiming to discover effective， sensitive， and precise detection methods， to support advancements and innovations in lipophilic shellfish toxin detection technologies in the future.

Keywords： lipophilic shellfish toxins; detection techniques; shellfish

贝类产品因丰富的营养价值和独特的风味口感深受消费者喜爱。然而，贝类以藻类为食，内脏和肌肉组织中存在蓄积的藻类毒素，这些毒素经食物链进入人体后会迅速产生毒性。贝类毒素结构复杂且种类繁多，根据其溶解性可分为脂溶性贝类毒素和水溶性贝类毒素，其中脂溶性贝类毒素主要是指含有特殊聚醚结构且易溶解于有机溶剂的毒素，包括原多甲藻酸毒素、短裸甲藻毒素、环亚胺类毒素、大田软海绵酸毒素、扇贝毒素和虾夷扇贝毒素等。由于脂溶性贝类毒素毒性大、致毒反应快，且难以被加热破坏，易给食用者带来安全威胁。此外，脂溶性贝类毒素的危害还具有突发性和广泛性。因此，该成分的定性、定量检测与含量控制对于保障消费者的食用安全至关重要。本文总结了脂溶性贝类毒素常见的检测技术及应用，以期为该类毒性物质检测方法的选择和脂溶性贝类毒素检测技术的发展提供参考。

1 小鼠生物法

小鼠生物法是将样品提取液注射入小鼠腹腔，通过观察小鼠的反应来计算样品毒力的一种生物学检测方法。TAKESHI等[1]最早使用小鼠生物法对贝类进行毒性研究，结果在贝类的肝胰腺中发现了一种新型的脂溶性毒素。由于能够真实反映贝类毒素在生物体内的情况，小鼠生物法已被美国、欧盟、日本和中国等多个国家和组织认定为贝类毒素检测的标准方法。随着技术的不断发展和完善，该方法的准确度大幅提升，覆盖的目标物种类也越来越多，检出限可达到ng·mL-1级别。

小鼠生物法的结果对毒素危害性分析和建立其安全性评价体系有直接的指导意义，且使用范围广，无须借助大型分析仪器，目前仍然作为贝类毒素的常规监控分析技术。然而，该方法存在不能确定毒素结构，灵敏度有限、假阳性高，检测结果受小鼠的品系、体重、批次等影响较大，小鼠选育和培育成本高和实验时间长等问题，且动物实验在动物福利等方面争议较大，因此，小鼠生物法已逐渐被其他操作简便、可比性强、费用较低的检测方法替代。

2 细胞毒性测试

细胞毒性测试是将毒性物质加入选定的细胞中，通过细胞生长和存活等情况对毒素进行定量测试。研究者可通过细胞存活率或融合度等体现细胞活力的变化指标来反映脂溶性贝类毒素对细胞的毒性作用。FLANAGAN等[2]基于细胞毒性测试原理，将混合毒素与HepG2或ECV-34细胞系接触，建立一种双终点检测方法。该方法可通过暴露于样品3 h后的形态学检查检测大田软海绵酸类毒素，再通过相同细胞暴露于样品24 h后的存活率测试检测原多甲藻酸毒素，可用于两类脂溶性贝类毒素的鉴定。黄海燕等[3]利用大田软海绵酸能破坏细胞F-肌动蛋白的聚合，探讨大田软海绵酸对HL-7702细胞的毒性效应，并根据被标记的F-激动蛋白荧光强度的变化，建立间接检测大田软海绵酸毒素的方法。结果表明，检测数据在2.5～40.0 nmol·L-1时线性关系良好，检测限值可达到20.1 μg·kg-1，方法加标回收率在92.76%～96.49%，可用于有毒贝类的筛查与检测。

细胞毒性测试相较于小鼠生物法，检测的灵敏度和准确度得到提升。同时，用细胞实验替代动物实验，也符合国际3R原则。细胞毒性测试法除了能检测毒性大小，还可以作为研究毒素致毒机理的良好模型。但是，细胞毒性测试也存在一定的局限性。例如，细胞培养需要额外的培养室和专业的培养人员进行无菌操作，实验周期长；细胞的差异和培养条件等会影响细胞毒性测试的准确性；该方法特异性和重现性较差。

3 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法是一种基于抗原抗体反应的定量检测方法，具有高通量、灵敏度高、特异性好、重复性强和检测快速等优点，是国际通用的一类免疫学检测方法。SAMDAL等[4]制备了羊多克隆抗体，建立了用于贝类、藻类细胞和培养上清液中原多甲藻酸毒素的酶联免疫吸附定量法，总原多甲藻酸毒素检出限为57 μg·kg-1，低于欧盟安全限量。SASSOLAS等[5]使用酶标大田软海绵酸建立的直接竞争酶联免疫吸附法检出限为0.006 mg·L-1，灵敏度比基于间接标记的常规免疫测定法高10倍。酶联免疫吸附法检测脂溶性贝类毒素已被世界多国采用，市场上也有多种商品化试剂盒。

与生物分析测试相比，酶联免疫吸附法检测的灵敏度与特异性高于生物分析测试，且实验周期短、操作简便、设备简单，更适合现场检测。但在实际检测时，抗体往往只针对单一组分，如果同组贝类毒素数量多且结构相似，就很容易产生交叉反应，导致假阳性结果的出现，稳定性和准确性较差。此外，该方法依赖高质量抗体，检测结果无法提供具体的成分信息。综上，该方法在脂溶性贝类毒素检测中的应用存在较大局限性。

4 仪器分析法

近年来，高效液相色谱-紫外检测、高效液相色谱-荧光检测和高效液相色谱-串联质谱检测（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）等化学仪器分析法被广泛应用于脂溶性贝类毒素的检测中。与小鼠生物法与酶联免疫法相比，高效液相色谱-荧光检测虽然更灵敏准确，但操作前处理过程烦琐，操作要求较高，且结构相似的毒素不易进行色谱分离。此外，由于多数脂溶性贝类毒素无法自身产生荧光，且紫外吸收弱甚至无吸收，导致高效液相色谱-紫外检测和高效液相色谱-荧光检测方法的应用受到较大限制。

随着质谱技术的快速发展，HPLC-MS/MS因分析速度快、灵敏度高、选择性好等优势，进入脂溶性贝类毒素检测领域。该方法前处理无须衍生，相同保留时间的目标物可以根据质荷比差异定量分析，还可通过质谱碎片实现对目标物结构的确认。

2012年，欧盟制定了HPLC-MS/MS测定软体动物中脂溶性海洋生物毒素的统一标准操作程序。2016年，中国也将HPLC-MS/MS纳入国家检测方法标准。为了达到更好的分离效率，实现更多目标物同时检测，提高回收率与重复性，许多研究人员也基于HPLC-MS/MS陆续开发出更多的检测方法。陈剑刚等[6]优化了前处理与仪器检测条件，样品经甲醇溶液提取和固相萃取净化后，使用高效液相色谱分离贝类产品中6种脂溶性贝类毒素，并用串联质谱检测，基质标准校正，外标法定量。建立的HPLC-MS/MS检测方法在各目标物对应浓度范围内线性系数良好，定量限为0.2～1.0 μg·kg-1，方法的选择性好、准确度高。刘青等[7]采用QuEChERS净化技术对4种脂溶性贝类毒素富集净化后，用乙腈与水溶液梯度洗脱，C18柱分离，多反应监测模式扫描，外标法定量，平均回收率大于80%，相对标准偏差小于5%，方法线性关系良好，快速简便，灵敏度高，回收率、精密度和重现性较好，可用于进出口食用贝类中原多甲藻酸毒素等4种脂溶性贝类毒素的检测。万嘉峻等[8]采用纯甲醇提取，正己烷除油脂，富集净化后使用HPLC-MS/MS法检测，建立了同时定量分析10种脂溶性贝类毒素的检测方法。该方法基质干扰小，检出限为0.104～3.870 μg·kg-1，回收率和精密度高，可用于脂溶性贝类毒素的痕量检测。

5 结语

我国贝类毒素中毒事件时有发生，多种新型脂溶性贝类毒素不断出现，这使我国面临越来越严峻的海洋贝类食品安全风险。开发高效、准确的脂溶性贝类毒素检测技术成为当前研究领域的热点。随着各种检测方法的研究和实践，脂溶性贝类毒素的检测技术在小鼠生物法、细胞毒性测试、酶联免疫吸附法、仪器分析法等方面进展较快，特别是在高效液相色谱-串联质谱领域，已发展出多种灵敏、高效、稳定的检测方法，为脂溶性贝类毒素检测技术的发展提供了有力支持。

参考文献

[1]TAKESHI Y，YASUKATSU O，MAGOICHI Y.Occurrence of a new type of shellfish poisoning in the Tohoku district[J].Nsugaf，1978，44（11）：1249-1255.

[2]FLANAGAN A F，CALLANAN K R，DONLON J，et al.A cytotoxicity assay for the detection and differentiation of two families of shellfish toxins[J].Toxicon，2001，39（7）：1021-1027.

[3]黄海燕，黄爱君，付英斌，等.腹泻性贝类毒素的细胞F-肌动蛋白荧光检测法的建立[J].卫生研究，2012，41（3）：501-503.

[4]SAMDAL I A，LOVBERG K E，BRIGGS L R，et al.Development of an ELISA for the detection of azaspiracids[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2015，63（35）：7855-7861.

[5]SASSOLAS A，HAYAT A，CATANANTE G，et al.Detection of the marine toxin okadaic acid： assessing seafood safety[J].Talanta，2013，105：306-316.

[6]陈剑刚，朱炳辉，梁素丹，等.固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定贝类中的脂溶性贝类毒素[J].中国食品卫生杂志，2015，27（6）：624-629.

[7]刘青，曾广丰，王志元，等.QuEChERS净化技术结合高效液相色谱-串联质谱法测定食用贝类产品中4种脂溶性贝类毒素[J].现代食品科技，2015，31（12）：338-344.

[8]万嘉峻，孟凡华，代先东，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定10种脂溶性贝类毒素[J].分析科学学报，2022，38（2）：154-160.