龙牙百合鳞茎生长点石蜡切片技术改良研究

引用格式：杨林澔，陈淼，李庠，等. 龙牙百合鳞茎生长点石蜡切片技术改良研究[J]. 湖南农业科学，2024（6）：10-13，20.

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2024.006.003

收稿日期：2023-12-13

基金项目：湖南省科学技术厅种业创新项目（2021NK1005）；湖南省自然基金项目（2023JJ30292）

作者简介：杨林澔（1998—），男，山西河津人，硕士研究生，主要从事观赏园艺研究。

通信作者：李玉帆

摘要：为了准确观测龙牙百合鳞茎生长点的生长分化过程，以龙牙百合冷藏期间的鳞茎为试验材料，在传统石蜡制片法的基础上，对脱水、透明等步骤进行优化并筛选了最佳的甲苯胺蓝染色方法。试验获得的百合鳞茎生长点石蜡切片制作改良方法为：将百合鳞茎剥开鳞片至可观察到茎尖生长点，修整为5 mm大小的立方体投入FAA固定液中，保存一周；用85%乙醇（2 h）、95%乙醇（2 h）、100%乙醇（3 h）进行脱水处理，再用二甲苯与乙醇等比例溶液（2 h）、纯二甲苯（3 h）进行透明处理；将透明好的材料放入石蜡+二甲苯溶液（体积比2∶3）中，在37 ℃的恒温箱中浸蜡2 d，期间多次少量加入石蜡；之后在60 ℃

恒温箱更换纯石蜡2次，每次4 h，浸蜡后的材料在60 ℃的操作台上包埋，再切成厚10 μm的薄片，待蜡片完全伸展，将蜡片粘于均匀涂抹了赫伯特粘片剂的载玻片上，37℃烤片5 h，脱蜡复水后用1%甲苯胺蓝染液稀释150倍染色3 min。

关键词：龙牙百合；鳞茎生长点；石蜡切片；技术改良

中图分类号：S644.1; Q-331 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2024）06-0010-04

Improvement of Paraffin Sectioning Conditions for the Growing Point of Lilium brownii var. viridulum Baker Bulb

YANG Lin-hao1，2，CHEN Miao1，2，LI Xiang3，MA Jie3，LI Yu-fan1，2

（1. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Engineering Research Center for the Breeding and Utilization of High-Quality Flowers and Trees in the Mid-Subtropical Zone， Changsha 410128， PRC;

3. Hunan Cotton Science Institute， Changde 415000， PRC）

Abstract： To accurately observe the growth and differentiation process of the growing point of Lilium brownii var. viridulum Baker bulb， this study employed the conventional method to prepare the paraffin sections of the bulbs stored in the refrigerator. The dehydration and transparentizing steps were optimized and the toluidine blue staining method was selected. The conditions for preparing the paraffin sections were improved as follows. First， the scales of a lily bulb were peeled off to expose the growth point， which was then trimmed into a cube of 5 mm × 5 mm × 5 mm. The cube was fixed in FAA solution for one week， dehydrated with 85% ethanol for 2 h， 95% ethanol for 2 h， and 100% ethanol for 3 h， and then transparentized with the mixture of xylene and ethanol （1：1） for 2 h and pure xylene for 3 h. The transparent cube was then immersed in a mixture of paraffin and xylene （volume ratio of 2：3） at 37 °C for 2 days， during which a small amount of paraffin was supplemented multiple times. Afterwards， the mixture medium was replaced with pure paraffin in a thermostat incubator at 60 °C twice， each time for 4 h. After that， the material was embedded at 60 °C. The wax block was sliced into pieces with a thickness of 10 μm. After full extension， each slice was put onto a glass slide evenly coated with Herbert gelatin adhesive， and the slide was then heated at 37 °C for 5 h. After dewaxing and rehydration， the slide was stained with 1% toluidine blue staining solution diluted by 150 times for 3 min.

Key words： Lilium brownii var. viridulum Baker; growing point of bulb; paraffin section; technical improvement

龙牙百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）是

百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）的多年生球根草本植物，是我国三大食用百合之一，因鳞片饱满肥厚，形状似龙牙而得名[1]。龙牙百合在湖南隆回县有500多年的栽培历史，后引入江西万载，现已成为两个地方的中国地理标志产品[2]。龙牙百合花型优美，气味清香，有鲜切花、盆花观赏、或作花境等多种应用方式，具有较高的观赏价值；龙牙百合还是重要的药用植物，鳞片含有丰富的生物碱、蛋白质、淀粉、脂肪以及人体所需的各种维生素和微量元素，具有补肺养阴、清心安神、补中益气的功效。因此，龙牙百合是一种重要的药、食、观赏兼用植物，具有重要的经济开发价值。

百合鳞茎具有自然休眠特性，未解除休眠的鳞茎种植后会出现发芽率不高和盲花现象，不同品种的鳞茎需要不同程度的低温处理，才能打破休眠发芽生长。王家艳等[3]研究报道，不同种类的百合，鳞茎生长点生长分化的时间不同，有的是在冷藏期间发生，有的是在冷藏打破休眠后在种植期间茎尖开始进行分化[4]。精确掌握百合鳞茎生长点分化的进程对于百合的花期调控和周年生产非常重要[5]，目前还没有龙牙百合鳞茎生长点分化时间和进程的研究报道[4]。

石蜡切片是观察植物花芽分化进程的常见手

段[5-6]，传统石蜡切片制作方法在百合石蜡切片的制作过程中会出现无法形成完整的蜡带情况，甚至出现断裂、碎裂问题，影响后续观察。不少研究者针对不同植物材料的石蜡切片制片方法进行了改良研究[7]，取得了较好效果。本研究以龙牙百合为试验材料，在传统石蜡切片方法的基础上，通过对脱水、透明、浸蜡等步骤进行改良，探究适合龙牙百合鳞茎生长点石蜡切片的制作方法和染色方法，以期为进一步研究龙牙百合鳞茎生长点花芽分化进程提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

龙牙百合鳞茎，从湖南隆回一线情农业科技有限公司采购，鳞茎整齐饱满、无病虫害、无损伤，消毒后冷藏保存于湖南农业大学园艺学院8 ℃冷库。

FAA固定液、无水乙醇、二甲苯、固体石蜡、甲苯胺蓝染色剂，采购于长沙市博仪生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 固定 按照王原媛等[8]采用的石蜡切片固定与保存方法，随机取样大小统一的百合鳞茎，在显微镜下使用解剖针剥开鳞片至可观察到茎尖生长点，将材料修整为5 mm大小的梯形立方体（图1），加入约为材料体积15～20倍的FAA固定液，4 ℃保存一周以上。

1.2.2 脱水、透明、浸蜡 针对龙牙百合茎尖生长点的特点，以脱水（A）、透明（B）、浸蜡（C）为三

因素，每个因素设3种不同的处理方法（表1、表2、

表3），采用L9（33）正交试验设计，共组合成处理1

“A1B1C1”、处理2“A1B2C3”、处理3“A1B3C2”、处理

4“A2B1C3”、处理5“A2B2C2”、处理6“A2B3C1”、处理

7“A3B1C2”、处理8“A3B2C1”、处理9“A3B3C3”，各处理按照“脱水→透明→浸蜡”步骤操作。在脱水后，依据脱水材料放入二甲苯溶液中的变化判断脱水是否彻底，若溶液浑浊，出现白色沉淀，则脱水不干净；没有变浑浊则表示脱水干净。

1.2.3 包埋、切片 提前打开恒温台并融化石蜡，取出1.2.2处理好的样品进行石蜡包埋，操作时将样品侧放在金属模具中并在上方放置包埋盒，随后缓慢注入石蜡，待包埋盒表层石蜡凝结，缓慢放入冰水中等待脱模，包埋好的蜡块放入4℃冰箱中保存。切片前，先将蜡块边缘修整齐平，再将蜡块固定在转轮式切片机上，将蜡块切为薄片，切片厚度为10 μm；将切好的蜡带按顺序排列，待蜡片完全伸展，将蜡片粘于均匀涂抹了赫伯特粘片剂的载玻片上，将载玻片置于37 ℃的展片台上烤片5 h。

1.2.4 脱蜡复水 将装有载玻片的染色架依次进行二甲苯、乙醇浸泡脱蜡至蒸馏水冲洗处理：纯二甲苯10 min（2次）→1/2纯二甲苯＋1/2无水乙醇10 min→无水乙醇10 min→95%乙醇7 min→85%乙醇7 min→70%乙醇7 min→50%乙醇7 min→30%乙醇7 min→蒸馏水流水冲洗10 min，将载玻片上的石蜡溶洗干净，并选用完整、连贯的切片进行染色。

1.2.5 染色 脱蜡后的切片选用甲苯胺蓝染色液染色：将1%浓度甲苯胺蓝染色液用蒸馏水分别稀释50、100、150倍，选用相同脱水处理1.2.4制成的切片分组染色5 s 、10 s 、30 s、1 min 、3 min 、5min（表4），共得到18组不同染色处理的切片，随后置于37℃烘箱中烤片，等待观察。

2 结果与分析

2.1 百合茎尖石蜡切片不同脱水时间的效果比较

由图2可知，A1处理组放入纯二甲苯溶液后出现大量白色沉淀（图2a），A2处理组出现少量白色沉淀（图2b），A3处理组没有沉淀（图2c）。结果表明，A3脱水处理的材料脱水效果最好。

2.2 百合茎尖石蜡切片的切片效果比较

由表5可知，脱水处理相同，透明和浸染方法不同的三组处理组内比较，处理3、处理6、处理9的蜡块在切片时分别优于同一脱水处理组其他2个处理，说明在相同脱水条件下，延长透明时间、浸蜡时间的切片效果更好；处理3、处理6和处理9之间相比较，处理9切出的蜡带无断裂卷曲，蜡片无破碎缺失，切片效果最好，说明通过改良脱水、透明、浸蜡方法，制得的石蜡切片在切片过程中蜡带、蜡片的效果明显提升。结果表明，在百合茎尖石蜡切片制作中获得脱水、透明、浸蜡方法的最佳组合是处理9（A3B3C3）：脱水方法是85%、95%乙醇各1次，每次2 h，100%乙醇2次，每次2 h；透明方法是在石蜡+二甲苯溶液（体积比1∶1）中透明2 h，再在二甲苯中透明2次，每次1.5 h；浸蜡方法是石蜡二甲苯溶液（体积比2∶3）在37 ℃恒温箱停留2 d，期间多次少量加入石蜡，之后在60℃恒温箱更换纯石蜡2次，每次4 h。

2.3 百合茎尖石蜡切片甲苯胺蓝染色的优化

由图3可知，在染液稀释50倍时，染色时间1、3、5 min时材料呈现深绿色，细胞界限模糊，且切片部分区域大量染液进入细胞内导致区域颜色变深；染色5、10 s时切片颜色较浅，观察不清晰；染色30 s较为清晰。染液稀释100倍时，5、10、30 s时细胞虽然较为清楚，但颜色呈现紫色、较浅，染色不均；染色1 min与3 min的切片效果较为相似，整体呈现深绿色，染色均匀度较好，但横向比较同一时间梯度下剩余切片可知其稳定性一般，个别切片还有组织破碎的现象发生；染色5 min时着色效果最佳，细胞均呈淡蓝色且细胞形态清晰可见，低倍和高倍镜下观察效果均表现良好，所以在稀释100倍条件下，最适宜的染色时间为5 min。染液稀释150倍时，染色时间少于3 min的处理染色不均匀，其染色稳定性较差；染色时间为3 min时切片色彩对比度高，染色均匀度较好，其稳定性也比其他处理组要好；染色5 min组织比较符合预期，但相同染色时间的大量切片对比后，染色5 min组会出现深浅不一的情况，染色稳定性较差；综合比较下，3 min为稀释150倍甲苯胺蓝染液的最优染色时间。

将不同染色液稀释倍数在最佳染色时间下的石蜡切片照片在显微镜下观察比较，稀释50倍（图3A）与100倍（图3B）的染色液着色较深，染色后细胞边界与稀释150倍（图3C）相比更模糊，图3C清晰度最优，可以观察到完整的组织。结果表明，甲苯胺蓝染色龙牙百合鳞茎尖石蜡切片最佳的染色处理为1%甲苯胺蓝染液稀释150倍，染色3 min。

3 讨论与结论

材料的脱水是石蜡切片制备中重要的步骤，植物组织中含有大量水分，水和石蜡是不能溶合的，脱水能使组织中的水分完全除去，并使组织变硬，有研究表明脱水时间过久会造成材料硬化，切片时会碎裂[9]。本试验通过设置不同的乙醇浓度、时间来探究最适的脱水时间，得到最适的脱水方法为85%乙醇、95%乙醇脱水，再替换为100%乙醇脱水，提高了脱水质量，也减少了后续切片中组织破碎的风险，这与康云艳等[10]对黄瓜幼嫩茎段切片制作改良的结果一致，同时相比传统石蜡制片法，极大减少了脱水时间[5， 11]。

透明过程中使用的二甲苯具有一定毒性，操作时需要做好防护，透明步骤的时间也要适中，时间太短，酒精无法完全置换干净，会导致石蜡无法浸入材料，但是透明太久也可能造成组织硬化，影响切片。本试验将透明方法改良后，相比传统石蜡制片法[5]进一步缩短了透明时间，方便后续的实验操作。但在实际操作时，对于不同种类的植物材料，脱水和透明方法应该根据实际情况改变[8]。

浸蜡是石蜡制片中另一个重要的环节，本试验的材料为龙牙百合鳞茎茎尖，其特性是质地柔软、较为脆弱，根据这种特性应选择熔点为56～58 ℃的纯净石蜡。由于石蜡不易溶于二甲苯，故而需要延长浸蜡时间，另外第一次浸蜡要最好少量多次添加石蜡，并在之后经常更换纯蜡，以保证石蜡能够更完全渗透入材料，再与组织之间形成更为紧密的结合，形成一个整体，提升蜡块与切片的质量，这与李泽华等[12]的研究结果一致。在浸蜡的同时，要维持恒温箱内的温度稳定，防止出现温度变化过大的情况。操作时可以考虑将镊子先预热，再和材料一同放入恒温箱内操作，避免镊子插入或取出时，因石蜡的温度过低而凝固，影响效果[11]。

甲苯胺蓝作为较常见人工合成染料其染色效果与苏木精相类似，在观察组织结构时，染液过浅或过深会致使染色对比度不高，效果不佳，所以要根据材料特性配置染色液。在本次试验中，比较了不同染色液浓度及染色时间对石蜡切片制备效果的影响，结果表明最佳甲苯胺蓝染色体系为将1%浓度的甲苯胺蓝染液稀释150倍，在染缸中染色3 min。另外需留心溶液调制技巧，如染料现配现用等；染色期间还需特别注意水流清洗速度及操作时间，可以使用较低水流速度冲洗样品，显微切片效果更好。

本试验获得的百合鳞茎生长点石蜡切片制作改良方法为：将百合鳞茎剥开鳞片至可观察到茎尖生长点，修整为5 mm大小的立方体投入FAA固定液中，保存一周；使用85%乙醇（2 h）、95%乙醇（2 h）、100%乙醇（3 h）进行脱水处理，再用二甲苯与乙醇等比例溶液（2 h）、纯二甲苯（3 h）进行透明处理；将透明好的材料放入石蜡+二甲苯溶液（体积比2∶3）中，在37 ℃的恒温箱中浸蜡2 d，期间多次少量加入石蜡；之后在60℃恒温箱更换纯石蜡2次，每次4 h，浸蜡后的材料在60 ℃的操作台上包埋，切成厚10 μm的薄片，待蜡片完全伸展，将蜡片粘于均匀涂抹了赫伯特粘片剂的载玻片上，将载玻片置于37℃的展片台上烤片5 h，脱蜡复水后用1%甲苯胺蓝染液稀释150倍染色3 min。

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（责任编辑：谢培庚）