屋尘螨过敏原Der p 1 在毕赤酵母中的重组表达与纯化

摘要：基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1 的重组表达与纯化。首先，采用毕赤酵母GS115 表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1，其产量可达100 mg/L，进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L，并实现3 L 反应器发酵产量提高到1 g/L。其次，对上述重组蛋白发酵液分别使用阳离子交换层析及亲和层析进行了纯化工艺优化，目的蛋白得率达到60.7%。本研究为后续PreProDre p 1 诊断试剂盆的开发提供了参考。

关键词：尘螨过敏原；毕赤酵母；重组表达；蛋白纯化；基因拷贝

中图分类号：Q933 文献标志码：A

过敏是指人体接触环境中部分过敏原因子后，所引发的一系列过度反应的现象，过敏反应也称超敏反应。过敏原首次进入机体后会诱导B 细胞分泌IgE 抗体，通过Fc 片段与肥大细胞、嗜碱性粒细胞结合。当过敏原再次进入机体，被IgE 抗体的抗原结合片段Fab 捕获，进一步刺激肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺、白三烯等物质导致机体过敏[1]。过敏患者常常伴随着过敏性鼻炎、过敏性皮炎、哮喘等症状[2]。尘螨过敏的诊断需要使用尘螨检测试剂盒，而该试剂盒的关键成分为纯化的尘螨过敏原。

屋尘螨 （Dermatophagoides pteronyssinus） 第一类过敏原Der p 1 是屋尘螨最重要的过敏原， 超过80% 过敏患者血清中都可以检测出这类过敏原[3]。Der p 1 由基因DERP1 编码，其全长序列包括18 个氨基酸组成的螨虫天然信号肽，80 个氨基酸组成的前导肽，以及222 个氨基酸组成的成熟肽，成熟蛋白理论分子量大小为25 kDa[4]。Der p 1 是一类半胱氨酸蛋白酶，属于木瓜蛋白酶家族[5]，Der p 1 的过敏原依赖于其酶活性[6]。Der p 1 的获取主要通过大量饲养螨虫并利用化学方法进行提取，重组DNA 技术的问世使过敏原的生产速度更快，纯度更高，重组过敏原已逐渐成为天然过敏原的替代品。巴斯德毕赤酵母因具有廉价、易操作、发酵产物易分离纯化等方面的优势，且其拥有与较为温和的蛋白翻译后的修饰能力，逐渐成为重组过敏原最主要的生产宿主[7-8]。

重组Der p 1 是通过酶原形式 （ProDer p 1） 合成，即成熟肽前面含有一段由80 个氨基酸组成的前导肽（Pro-Sequence）[9]，通常需要在体外pH 4.5 醋酸盐环境下对该前导肽进行切割处理，进而获得具有酶活性的Der p 1[10-12]。前导肽在半胱氨酸蛋白酶折叠和分泌过程中扮演着非常重要的作用：首先，前导肽可以充当分子内分子伴侣的作用帮助成熟肽折叠[4，12]；其次，前导肽可以作为半胱氨酸蛋白酶内源性抑制剂，阻断底物与酶活性位点结合，避免了该酶在分泌过程中对细胞产生毒害以及自身被降解[13-14]。Chevigne等[12] 将大肠杆菌重组表达的前导肽与重组Der p 1一起孵育，发现随着前导肽浓度的增加，Der p 1 的酶活性也逐渐降低。Chruszcz 等[15] 和Meno 等[4]也报道了前导肽的存在覆盖了成熟肽的活性中心，而使其酶活性丧失[16]。除此之外，ProDer p 1 上含有两个糖基化位点，分别位于前导肽和成熟肽。重组Der p 1糖链的存在被认为会降低ProDer p 1 向成熟Der p 1转化的速率[17]。前导肽糖基化的存在会使重组Der p 1在-61 位点处发生部分切割，导致表达出的蛋白在SDS-PAGE 上呈现出两个条带，分别对应34 kDa 和32 kDa。如果将该位点的糖基化进行突变，那么表达出的蛋白会很均一，对应分子量为32 kDa。而前导肽在裂解过程中，其附带的糖链也会被一起去除。为了得到与天然Der p 1 分子量相同的重组蛋白，人们一般选择突变成熟肽上的糖基化位点[18]。