高效液相色谱法测定代可可脂巧克力中的赤藓红色素

摘""""" 要：建立一种简便快速处理代可可脂巧克力样品并检测样品中赤藓红色素含量的高效液相色谱方法。样品在酸性条件下提取，沉淀蛋白，调节pH至中性，高效液相色谱仪进行检测。在该方法条件下，赤藓红在0.2～10.0 mg·L^-1范围内呈现良好线性，相关系数gt;0.999，检出限为0.2 mg·kg^-1，定量限为0.6 mg·kg^-1。在2.0、10.0、50.0 mg·kg^-1的加标浓度水平下回收率为90.1%～95.3%，相对标准偏差RSD为1.03%～3.29%（n=6）。本法操作简便、基质干扰小、灵敏度高、快速准确，可适用于代可可脂巧克力中赤藓红色素的快速检测。

关" 键" 词：高效液相色谱；赤藓红；色素；检测

中图分类号：O657.7⁺2"""" "文献标识码： A"""" 文章编号： 1004-0935（2023）08-1229-04

食用色素，又称为着色剂，分为合成色素（焦油色素）、天然色素和其他色素。其中，合成色素因其性质稳定、色彩鲜艳、易于着色、成本低廉等优点而在食品生产过程中得到广泛使用^[1]。但人工合成色素的过度食用会损害人体健康，研究表明，某些合成色素过度摄入不仅可能引起机能亢进，对甲状腺等造成伤害，甚至在人体内代谢后还可能产生致癌物质，大量摄入会对人体产生毒害作用，特别是对儿童的生长发育产生不利影响^[2]。因此，世界各国如美国、俄罗斯、欧盟等都对合成色素的使用都有严格的规定，尽管它们都经过评估较为安全，但仍存在一定风险^[3]。

赤藓红色素（INS 127）属于人工合成色素的一种，是我国允许使用的11种人工合成色素之一，多用于可可制品、糖果、糕点上彩装以及果蔬汁饮料等食品中，以提高其产品的鲜艳度，吸引消费者^[4]。根据我国食品安全国家标准GB 2760—2016的规定，赤藓红及其铝色淀在可可制品、巧克力和巧克力制品（包括代可可脂巧克力及制品）的最大使用量不得超过0.05 g·kg^-1。

目前，食品中赤藓红色素的检测方法主要有分光光度法^[5]、高效（超高效）液相色谱法^[6-9]、薄层色谱法^[10]、SERS快速检测法^[11]、共振瑞利散射法^[12]等。《食品国家安全标准 食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016）^[13]采用高效液相色谱法对饮料、配制酒、硬糖、蜜饯、淀粉软糖、巧克力豆及着色糖衣制品中合成着色剂进行检测，其中含赤藓红的样品采用液-液分配法进行检测，但该方法操作步骤繁琐，测试过程中待测物损失较大，再加上代可可脂巧克力中含有乳粉、油脂等多种成分，基质比较复杂，采用液-液分配法测试过程中易产生浑浊，有机相与水相间不易分层，前处理效果不理想。本研究拟探究代可可脂巧克力样品中赤藓红色素的前处理方法的简化，并采用高效液相色谱法进行" 测定。

1" 材料与方法

1.1" 试剂与仪器

试剂：甲醇，色谱纯，Fisher公司；盐酸，优级纯，国药集团；氨水，色谱纯，ANPEL公司；无水乙醇，优级纯，国药集团；乙酸铵，色谱纯，Fisher公司；赤藓红标准品，85.7%，DR。

仪器：高效液相色谱仪，E2695配备2998二极管阵列检测器及Empower工作站，美国Waters公司；超纯水制备系统，Milli-Q，美国Millipore公司；电子天平，SQP，德国赛多利斯公司；超声波清洗器，KQ-250DB，昆山市超声仪器有限公司；离心机，H1750R，长沙湘仪离心机仪器有限公司；涡旋混合仪，Vortex Mixer T2，上海Titan Scientific Lab。

1.2" 方法

1.2.1" 样品前处理

称取5.000 g样品于离心管中，加入20 mL 10%盐酸溶液，涡旋混匀，超声40 min，转移至50 mL容量瓶中，加入20 mL无水乙醇，涡旋混合均匀后，用氨水调pH至6.0～7.0，用水定容，-20 ℃冷冻离心，取上清液过0.45 μm滤膜，供液相色谱分析。

1.2.2" 标准溶液配制

称取预先干燥的赤藓红标准物质0.029 2 g于25 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，得到赤藓红标准储备液（1 000 mg·L^-1）。

吸取赤藓红标准储备液（1 000 mg·L^-1），用超纯水稀释成100 mg·L^-1的标准中间液，再依次稀释成0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·L^-1的标准系列工作溶液。

1.3" 色谱条件

色谱柱为Syncronis C18反相色谱柱（Thermo Scientific，150mm×4.6mm，5 μm）；流动相A为""" 20 mmol·L^-1乙酸铵溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件见表1；柱温为35 ℃；流速为1.0 mL·min^-1；二极管阵列检测器，检测波长为530nm；进样量为10 μL。

2" 结果与讨论

2.1" 色谱条件选择

2.1.1" 检测波长的选择

通过在200～800 nm波长下扫描赤藓红光谱图发现，赤藓红的最大吸收波长为530.8 nm，见图1。

因此选择530 nm为检测波长，可以有效排除其他杂质干扰，得到峰形清晰对称的赤藓红色谱图（如图2所示），保留时间为12.047 min。

2.1.2" 洗脱条件的确认

在表1梯度洗脱条件下，可以看到在530 nm下的代可可脂巧克力样品中含有的两种色素成分可以得到有效分离（如图3所示），且单个样品分析用时较短，因此选择该梯度洗脱条件用于本方法测定。

2.2" 微孔滤膜的选择

在测试过程中发现，由于尼龙材质的微孔滤膜对赤藓红的吸附作用，经过微孔滤膜过滤后，滤膜上肉眼可见明显物质吸附，其色谱峰面积明显下降，而使用混合纤维素滤膜则可以得到较好的测试"" 结果。

2.3" 标准曲线和检出限的确定

2.3.1" 标准曲线

按1.2.2配制标准曲线工作液，依次注入高效液相色谱仪进行测定，以峰面积（A）与对应的标准系列工作液质量浓度（C）绘制标准曲线，如图4所示。由图4可以看出，赤藓红在0.2～10.0 mg·L^-1范围内呈良好的线性关系，相关系数r大于0.999，线性方程为y=54 737.1x-935.9。

2.3.2" 方法检出限和定量限的确定

方法检出限以3倍信噪比来计算，定量限以" 10倍信噪比计算，则本方法检出限（LOD）为""""" 0.2 mg·kg^-1，定量限（LQD）为0.6 mg·kg^-1。

2.4" 方法重复性试验

选取同一份含有赤藓红的代可可脂巧克力样品，重复测定6次，其结果见表2。从表2中可以看出，本方法的重复性较好，所测赤藓红的RSD为1.08%，小于5%。

2.5" 方法回收率及精密度

本方法采用保留时间定性，外标法定量。分别在不含有待测物质的代可可脂巧克力样品中添加低（2.0 mg·kg^-1）、中（10.0 mg·kg^-1）、高（50.0 mg·kg^-1）3个质量浓度水平的标准溶液，每个加标水平平行测定6次，结果见表3。

由表3可以看出，经计算得到的赤藓红加标回收率在90.1%～95.3%范围内，相对标准偏差（RSD）分别为1.03%、2.56%、3.29%，RSD均小于5.0%，满足测试要求。

3" 结 论

本研究简化了代可可脂巧克力中赤藓红色素的前处理方法，建立了快速检测代可可脂巧克力中赤藓红色素的方法，样品在酸性条件下提取，并用乙醇沉淀样品中的蛋白质，离心后用C18反相色谱柱分离，注入高效液相色谱仪进行测定。本方法操作简便、基质干扰小，线性关系良好，检测灵敏度高，快速准确，可为代可可脂巧克力中赤藓红色素的快速检测提供新的思路。

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Determination of Erythrosine in Cocoa Butter

Substitute Chocolate by HPLC

LIU Ying， YU Jiao-zhu， LI Qiao-lian， LIN Yang

（Shenyang Food and Drug Inspection Institute， Shenyang Liaoning 110122， China）

Abstract： A simple and rapid HPLC method for the treatment of cocoa butter substitute chocolate samples and the determination of erythrosine content in the samples was established. The samples were extracted under acidic conditions， precipitated with ethanol， and then the pH was adjusted to neutral. The samples were detected by HPLC. Under the condition of this method， erythrosine showed good linearity in the range of 0.2～10.0 mg·L^-1， the correlation coefficient was gt;0.999， the detection limit was 0.2 mg·kg^-1， the quantification limit was 0.6 mg·kg^-1. The recoveries were 90.1%～95.3% at 2.0， 10.0，50.0 mg·kg^-1， and the relative standard deviations （RSD） were 1.03%～3.29% （n=6）. The method has the advantages of simple operation， low matrix interference， high sensitivity， rapid and accurate， and can be used for the rapid detection of erythrosine pigment in cocoa butter substitute chocolates.

Key words： "HPLC; Erythrosine; Pigment; Determination