动力学结合现代技术的肉苁蓉润制过程表征

陈丽霞 叶丽芳 张 英,2 吴孟华,2 曹 晖,3 马志国,3

(1 暨南大学岭南传统中药研究中心,广州,511400; 2 国家中药现代化工程技术研究中心岭南资源分中心,广州,511400; 3 广东省中医药信息化重点实验室,广州,510632)

干燥的中药材在切制前通常会进行适当的软化处理,使其质地变得柔软适中,便于切制。而润法便是常用的软化处理方法。另外,在达到切制要求的前提下,尽可能减少与水接触的时间,减少有效成分的流失,做到药材软硬适度、药透水尽、避免伤水[1]。但是,检查软化程度是否符合切制要求的评判标准过于依赖人的主观感受,主要是凭老药工的主观经验,传统经验的科学性得不到合理解析[2]。因此,对润制过程中药材的软化程度进行科学解析是很有必要的。

近年来,由于低场核磁共振(Low-field Nuclear Magnetic Resonance,LF-NMR)及磁共振成像技术(Magnetic Resonance Imaging,MRI)具有准确、快速、无毒、无害的优点,已被应用于农作物体内水分变化、油脂组成、品质等的测定[3-4]。质构仪又叫物性测定仪,由于其客观性强、操作性强,也越来越受到研究人员的青睐,已广泛应用于各领域[5]。LF-NMR和质构仪可从水分和质地两方面分别阐释药材的润制机制。刘庆珊等[6]采用LF-NMR/MRI、质构仪表征白芍的润制过程,对研究白芍软化“看水头”的传统经验的数据化表征提供了一种客观的评价手段。中药润制其实是一个动态的吸水膨胀过程,研究其动力学过程,可为优选药材润制工艺参数、表征中药润制过程提供理论数据依据。采用吸水动力学结合LF-NMR/MRI、质构仪研究中药润制过程,为阐明中药润制传统经验的科学内涵提供了客观依据[7-9]。

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma或管花肉苁蓉Cistanchetubulosa(Schenk)Wight干燥带鳞叶的肉质茎,具有补肾阳、益精血、通肠润便的功效[10]。肉苁蓉片的炮制方法为“除去杂质,洗净,润透,切厚片,干燥”。但关于肉苁蓉炮制的研究多以酒肉苁蓉、黑豆制肉苁蓉蒸制的化学成分变化为主,缺少对肉苁蓉润制过程中水分及质地变化的研究[11-12]。本研究以肉苁蓉为研究对象,在润制动力学的基础上,利用LF-NMR和质构仪对润制过程中水分分布和质地进行直观、量化表征,为肉苁蓉润制关键技术参数的确定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 肉苁蓉药材购自内蒙古巴彦淖尔市,经暨南大学马志国教授鉴定为列当科植物肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma干燥带鳞叶的肉质茎。参照中华中医药学会2018年发布的《中药材商品规格等级——肉苁蓉》,同时结合样品实际情况,对肉苁蓉药材进行分档:中部直径>2.5 cm定为大档;2 cm<中部直径≤2.5 cm定为中档;中部直径≤2 cm定为小档[13]。

1.1.2 试剂与仪器 松果菊苷(批号:PFS-S00301904003,纯度>98%)、肉苁蓉苷A(批号:PFS-R05002009014,纯度>98%)、毛蕊花糖苷(批号:M-011-181106,纯度>98%)均购自成都瑞芬思生物科技有限公司,甲酸(上海麦克林生化科技有限公司,批号:C14200290)、甲醇[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,批号:F22M77201]均为色谱纯,甲醇(上海泰坦科技股份有限公司,批号:P2219181),为分析纯;电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司,型号:DHG-9123A)、质构仪(Stable Micro System公司,英国,型号:TA-HD plus)、中尺寸核磁共振成像分析仪(上海纽迈分析仪器股份有限公司,型号:MesoMR23-060H-1)、液相色谱仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,型号:U-3000]、万分之一电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司,型号:FA 2204B)、十万分之一天平(奥豪斯仪器有限公司,型号:EX225DZH)、数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,型号:KQ5200DE)。

1.2 方法

1.2.1 润制过程吸水动力学和膨胀动力学考察 称取大中小档肉苁蓉药材各约500 g,称重,采用排水法测量体积。将药材放入润制容器中,用湿纱布覆盖,润制过程中每4 h称重1次,同时测量不同润制时间药材的体积,计算各时间点样品的吸水率及膨胀率,平行操作3次,计算平均值。吸水率=(Mn-M0)/M0×100%,式中Mn为不同润制时间肉苁蓉的质量,M0为肉苁蓉初始质量;膨胀率=(Vn-V0)/V0×100%,式中Vn为不同润制时间肉苁蓉的体积,V0为肉苁蓉初始体积。

1.2.2 吸水动力学、膨胀动力学非线性拟合 采用Origin 2021 64Bit软件,以润制时间(h)为横坐标,分别以药材的吸水率(%)和膨胀率(%)为纵坐标,对肉苁蓉润制过程进行动力学非线性拟合。

1.2.3 润制过程水分迁移分析 横向弛豫时间(Transverse Relaxation Time,T2)测定:取不同润制时间的中档肉苁蓉样品,用吸水纸吸去表面水分后称重,放入永久磁场的中心位置,利用多脉冲回波序列(Carr-purcell-meiboom-gill,CPMG)检测样品T2,平行测定3次,取平均值。采用CPMG扫描采集核磁信号,通过调整多层自旋回波序列(Multi-slice Spin Echo,MSE)的选层梯度、相位编码梯度和频率编码梯度,分别获取样品俯视和正视成像数据,然后利用sirt算法,迭代次数为100 000次进行反演得到T2谱图。T2试验主要参数:主频为21 MHz,偏移频率为252 158.18 Hz,90°脉宽为8.00 μs,180°脉宽为17.04 μs,累加采集次数为4,回波时间为0.300 ms,回波个数为8 000,采样频率为100 kHz。T2可以反映氢质子所受的束缚力及其自由度,H质子所受束缚越小或自由度越大,T2弛豫时间越长,在T2图谱上峰位置较靠右;反之则T2弛豫时间越短,在T2谱上峰位置较靠左[14]。肉苁蓉润制过程中H质子主要源于水分子,所以可以通过弛豫时间的变化来分析物质的含水量和水分分布[15]。T2在0.1～10 ms之间的可表示为结合水T21,10～100 ms之间的可表示自由水T22,而100～1 000 ms之间的可表示为油脂T23[16]。

MRI检测:采用MSE采集T2测定项下各样品横断面的氢(Hydrogenium,H)质子密度图像,使用图像处理软件绘制和处理MRI图像。MRI成像参数:层数6,层厚2 mm,层间隙1 mm,采集次数4,重复时间1 000 ms,回波时间20 ms,视野100 mm×100 mm,频率方向256,编码步数192。MRI利用现代空间编码技术处理H质子磁共振信号来获得H质子的密度图像,进而得到水分在样品的内部分布情况[17]。MRI图像为灰度图,亮度越高说明H质子状态越活跃,亮度低则反之[18]。用图像处理软件将灰度图转化为伪彩图,能更好地判断图像的细节部分。

1.2.4 润制过程质构特性分析 采用质构仪测定1.2.3项下各样品的质构特性,参数设置:选用TA-9探头,触发点载荷4 g,预测试速度2 mm/s,测试速度1.5 mm/s,返回速度1.5 mm/s,穿刺距离10 mm,每个样品重复测定3次,选择负载单元为10 000 g的质构仪感应元件。可获得物性指标有:样品硬度(g)、压缩循环功(mJ)、黏力(g)、黏性(mJ)、胶着性(g)等。采用Origin 2021 64Bit软件进行分析处理。

1.2.5 润制过程中浸出物考察 将1.2.3项中不同润制时间的肉苁蓉样品,切片,干燥,按照2020年版《中华人民共和国药典》中肉苁蓉项下浸出物的测定方法,分别测定各样品的浸出物含量[10]。

1.2.6 润制过程中指标性成分考察 1)色谱条件:采用COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ(250 mm×4.6 mm)色谱柱;流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脱(0 min,30%A;30 min,40%A;35 min,30%A;40 min,30%A),流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长330 nm;进样量为10 μL。2)对照品溶液的制备:取松果菊苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷的对照品适量,精密称定,加30%甲醇制成每1 mL含松果菊苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷分别为1.02 mg、0.23 mg、1.30 mg的混合溶液,即得。3)供试品溶液的制备:取不同润制时间的干燥肉苁蓉粉末(65目)1 g,精密称定,加70%甲醇溶液50 mL,称量,浸泡30 min后,超声提取30 min,放冷后加70%甲醇补足减失的量,滤过,取续滤液以0.45 μm微孔滤膜滤过,即得[19]。

2 结果

2.1 吸水动力学与膨胀动力学

2.1.1 吸水动力学/膨胀动力学曲线 36 h内,肉苁蓉的吸水率和膨胀率随着润制时间的增加而增大,且在同一温度下,肉苁蓉档次越小,吸水率和膨胀率越大。另外,在同一档次下,温度越高吸水率和膨胀率越大;不同档次的润制终点也不同。见图1。

图1 肉苁蓉吸水动力学及膨胀动力学曲线

图2 肉苁蓉吸水动力学及膨胀动力学拟合曲线

2.1.2 吸水动力学和膨胀动力学拟合曲线 肉苁蓉吸水动力学和膨胀动力学非线性拟合曲线及方程,肉苁蓉润制过程吸水率与膨胀率的变化情况可被ExpDec1非线性方程拟合,R2均达到98.9%以上,拟合效果良好。这表明肉苁蓉润制过程中吸水率和膨胀率随润制时间的变化曲线符合一级动力学方程:y=A1*exp(-x/t1)+y0。此模型可简单预测各档次肉苁蓉在10 ℃、20 ℃、30 ℃下不同润制时间的吸水率和膨胀率,可及时了解肉苁蓉润制过程中的水分含量变化,避免药材在润制过程中造成伤水,有利于保证饮片质量。见图2,表1～2。

表1 肉苁蓉润制过程中吸水动力学拟合参数值

2.2 润制过程水分迁移分析

2.2.1 T2测定 肉苁蓉润制过程中,水分的状态和变化。在谱图上有出现3个波峰,根据T2的差异将水划分为3种存在状态。润制开始时,内部所含水分几乎均为结合水T21,随着润制时间的增加,自由水T22比例增加。24 h时T21峰面积比例为14.484%,T22峰面积比例为85.005%。见图3,表3。

表2 肉苁蓉润制过程中膨胀动力学拟合参数值

2.2.2 MRI检测 随着润制时间的增加,水分逐渐由外向内渗入。24 h时,表皮和皮层区已是亮黄色,说明含水量高。但是由于肉苁蓉含糖量高,髓部本身较柔软,此时内外硬度已经一致。继续润制,内部水分含量也并未显著增长。见图4。

2.3 润制过程质构特性分析 随着润制时间的增加,肉苁蓉各物性指标逐渐下降。24 h时,肉苁蓉内外硬度一致,硬度为1 560 g,此时药材便于切制,未见伤水;32 h后,各物性指标趋于稳定,此时切制药材有水分渗出。见表4,图5。

表3 肉苁蓉润制过程中各峰面积变化(n=3)

图3 肉苁蓉润制过程的T2谱图

图4 不同润制时间肉苁蓉MRI伪彩图

图5 不同润制时间肉苁蓉的质构变化

2.4 润制过程中浸出物和指标成分变化 随着润制时间的增加,浸出物有逐渐下降趋势;松果菊苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷含量未发生明显变化。这说明肉苁蓉在润制36 h内,所含成分未损失。见表5。

3 讨论

中药切制前,常需要对药材进行软化处理,使干燥的药材质地变软,利于切制[20]。肉苁蓉一般以片状入药,须经润制后才利于切片[21]。另外,对润制终点的判断,缺乏可量化的评判指标,导致润制工艺难以把握,甚至影响饮片质量。本研究基于吸水膨胀动力学模型结合LF-NMR/MRI、质构仪等现代技术来直观量化表征肉苁蓉的润制机制,表明肉苁蓉润制过程是一个符合一级动力学吸水膨胀的过程,水分逐渐由外周向中心渗入,硬度逐渐变低。润制动力学过程、水分相态、物性指标的结合可以较好的表征药材润制过程,为阐明肉苁蓉润制传统经验提供科学、可量化的数据支持,为优选润制工艺提供科学依据。

表4 不同润制时间肉苁蓉的质构变化(n=3)

表5 不同润制时间肉苁蓉浸出物和指标成分含量变化(%,n=3)

同一温度下,随着润制时间的增加,药材的吸水率和膨胀率逐渐增大。在同一档次下,温度越高,吸水率、膨胀率越大。这可能是随着温度的增高,加速了水分子的运动,使其扩散速度增加,进而增加了润制速度。由拟合曲线可知,可采用一级动力学解释肉苁蓉润制过程中的吸水、膨胀过程。随着润制时间的增加,自由水和结合水的比例并不是连续增多或减少,同时,MRI伪彩图相邻时间点的图片亮黄色区域面积相差不大,24 h达到适合切制的软硬程度,继续润制横切面中心区域的自由水含量仍然低于仪器检出限,这说明肉苁蓉难以润制。这可能是由于肉苁蓉髓部细胞间间隙小,不利于水分渗入[22]。另外,肉苁蓉的油性也会造成水分难以渗透。对此,可以对药材孔道大小及多少、药材润湿的难易作进一步考察,更深入地阐释药材的润制过程。质构仪可以监测润制过程中药材各物性指标的变化。对质构仪测试模式和探头进行优化,使其更适合中药炮制。将质构仪与润药机结合,利用质构仪作检测系统,便可实现润制的智能化,将传统经验变成可量化操作的工艺。

利益冲突声明:无。