顺铂治疗鼻咽癌耐药机制与逆转策略研究进展*

韩蜜,伍梦玲,龙远雄,邓桂明

(1.湖南省肿瘤医院药学部,长沙 410013;2.湖南中医药大学第一附属医院科研部,长沙 410007)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma )是一种常见的头颈部恶性肿瘤[1]。鼻咽癌与Epstein Barr病毒(EB病毒)感染密切相关,EB病毒在鼻咽癌的患者中均有检测到[2-3]。由于鼻咽部解剖位置隐匿,首发症状缺乏特异性,大部分患者初诊时病情已进入中晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)[4],且部分已发生转移[5]。临床上鼻咽癌治疗采用放射治疗(放疗)为主,对于中晚期、复发性及转移性鼻咽癌的治疗,单纯放疗效果不佳。2021年《中国临床肿瘤学会(CSCO)鼻咽癌诊疗指南》继续推荐将诱导化学治疗(化疗)加同期放化疗作为Ⅲ或ⅣA期鼻咽癌的治疗模式[6],对于复发性及转移性的鼻咽癌采用铂类为主的双药或三药治疗。目前,对于一线含铂治疗方案出现耐药的复发性或转移性鼻咽癌患者,缺乏标准的挽救治疗方案,临床上通常选择一线未使用的药物进行治疗。至于免疫疗法,虽然国家药品监督管理局已批准特瑞普利单抗用于二线以上系统治疗失败的鼻咽癌患者,但目前尚无抗PD-1/PD-L1抗体治疗鼻咽癌的Ⅲ期研究结果公布[6]。

顺铂是目前鼻咽癌化疗中经常使用的一种细胞毒药物,在体内水解1个或2个氯离子之后,与DNA碱基共价结合形成Pt-DNA加合物,抑制DNA复制及转录,导致肿瘤细胞凋亡[7]。顺铂对提高鼻咽癌患者生存率、减少远端转移起着重要作用。但由于鼻咽癌细胞对顺铂的耐药削弱对化疗的敏感性,导致治疗失败。顺铂的耐药机制一般是DNA损伤修复、细胞凋亡抑制、药物外排和药物代谢改变等,这些耐药机制会影响肿瘤患者的治疗和预后[8-10]。因此,克服多药耐药问题成为鼻咽癌化疗过程的关键。

1 鼻咽癌化疗中的顺铂耐药机制

1.1肿瘤细胞DNA损伤自我修复能力增加 顺铂与鼻咽癌细胞DNA结合,形成复合物,造成DNA损伤,抑制其转录和复制,但部分损伤的DNA被修复,使已遭到破坏的鼻咽癌细胞继续存活。研究发现,DNA修复能力缺乏的细胞相比修复能力活跃的细胞,其对顺铂的治疗更加敏感。核酸剪切修复(nucleotide excision repair,NER)是肿瘤细胞修复铂类造成 DNA 破坏的主要途径,核苷酸切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementary gene 1,ERCC1)是NER复合物的主要成分[11],ERCC1是核酸切除修复家族中重要的基因,具有识别DNA链损伤、切割的双重功能,其表达量可直接影响 DNA修复的生理过程[12]。ERCC1可以与着色性干皮病基因家族F(XPF)形成二聚体,共同切除DNA 5'端的损伤部位,促进DNA修复[13]。因此,ERCC1的表达量增加可以使NER通路活性增强,最终使顺铂破坏的DNA修复能力增强,肿瘤细胞产生耐药,只有肿瘤组织中ERCC1低表达的患者可以从铂类药物中获益[14]。研究显示,ERCC1基因表达异常可能影响鼻咽癌患者使用顺铂的疗效,其蛋白的表达可以影响基因的改变,鼻咽癌患者中ERCC1表达增加者,生存率低,对顺铂耐药性增加[15]。除了上面提到的 NER,与顺铂耐药相关的DNA修复通路还有碱基切除修复(base excision repair,BER),X射线交错互补修复基因1(X-ray repair cross-complementing gene 1,XRCC1)是该通路中的重要蛋白,改变蛋白的多态性可改变修复酶的结构从而影响其肿瘤易感性。XRCC1在BER 通路修复过程中主要扮演骨架蛋白的角色,它可以与DNA连接酶Ⅲ和多聚ADP核糖聚合酶同时相结合,作用于顺铂所导致的DNA损伤处,将各个有活性的不同组分聚合在一起,把损伤的DNA移除,发挥修复作用,目前已发现XRCC1的突变,例如rs25487(R399Q),该突变可以导致XRCC1介导的DNA修复能力下降,从而对顺铂更加敏感。XRCC1的多态性与鼻咽癌关系研究已有部分报道,刘龙静[16]收集158例采用PF化疗方案鼻咽癌患者外周血,发现XRCC1codon399Gln/Gln基因型携带者化疗敏感性为Arg/Arg基因型携带者的3.500倍。

1.2药物摄取减少 顺铂主要通过被动扩散进入细胞,细胞对顺铂的摄取与其浓度呈正比[17]。研究表明,顺铂进入细胞还有其他摄取方式,最有可能的候选者为铜转运蛋白CTR1 和CTR2,以及有机阳离子转运蛋白OCT2,这些跨膜蛋白的下调与铂类药物的耐药性有关[18-19]。铜代谢途径参与顺铂的摄取和排除,CTR1蛋白通过调节细胞内铜稳态而发挥作用,这一结论最初在酵母中发现。ISHIDA等[20]使用诱变筛选,明确CTR1是酵母中顺铂的摄取转运蛋白,在mCTR1等位基因缺失的小鼠细胞系中顺铂的摄取减少,耐药性增加[21]。CTR2可将CTR1剪切成较小的片段,调节铜/顺铂的储存,使得铜/顺铂的转运能力减弱[22]。有专家做过临床试验,使用铜螯合剂可以使耐顺铂的肿瘤细胞恢复对顺铂的敏感度,肿瘤患者重新接受顺铂化疗。OCT2蛋白是有机阳离子转运蛋白,是一种多特异性转运蛋白,能将铂化合物转运至细胞内[23]。此外,另一种顺铂结合蛋白即抗氧化蛋白 (Atox1),也与顺铂耐药相关。Atox1是一种由68个氨基酸组成的可溶性蛋白质,通过直接与C端相互作用来获取铜,Atox1缺失导致对顺铂的耐药性增加[24]。

1.3药物排除增加 造成铂类药物胞内累积降低其中一种重要机制是在药物到达细胞内靶点之前被主动泵出。顺铂从细胞中排除是通过膜转运蛋白进行,主要由ATP驱动泵所导致。ATP水解释放能量,为膜转运蛋白提供能源,将药物排出细胞。P-糖蛋白(P-gp,ABCB1)是 ATP结合盒 (ABC)转运蛋白,当过表达时,可介导顺铂偶联物的外排,从而减少药物在细胞内蓄积,鼻咽癌细胞对顺铂产生耐药[25]。ABC转运蛋白还包括多药耐药蛋白 (MRPs)、MRP1、MRP2、MRP3 和 MRP5,MRP不仅定位于细胞膜上,还存在于高尔基滤泡处及内质网,可将细胞内药物隔离,使药物不能与靶点结合,从而产生耐药[26]。有学者研究发现,在顺铂耐药的鼻咽癌细胞中,MRP表达水平上调。

1.4药物被内源性硫醇分子灭活 肿瘤细胞内过表达的含硫生物分子,如谷胱甘肽(GSH)和金属硫蛋白(MT)等与顺铂具有很高的反应活性,这些富含半胱氨酸的低分子量蛋白质通过硫醇基团与顺铂结合,形成加合物,发生解毒作用使药物在细胞内失活[27]。这一类别硫醇分子的过度表达,使顺铂在细胞质内的蛋白结合增加,从而减少顺铂到达细胞核。谷胱甘肽是一种三肽硫醇分子(谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸),其作用是维持细胞生物功能,在细胞内与顺铂的解毒和清除有关,通过谷胱甘肽巯基转移酶1,形成Pt2+-GSH复合物,使得顺铂更容易被MRP2泵出细胞。有学者研究,顺铂能诱导鼻咽癌干细胞CNE-2增加谷胱甘肽、超氧化物歧化酶(SOD)的活性,CNE-2抗氧化应激能力增强,从而导致对顺铂的耐药。金属硫蛋白MT是一种高巯基含量蛋白,可与大量金属离子(如:铜、铬、锌和汞)等结合,调节细胞内金属稳态以及细胞内重金属解毒[28]。MT也已被证明其清除自由基和抗氧化能力比谷胱甘肽强,使药物没有到达细胞核即被清除,导致顺铂耐药,另一方面,使用顺铂治疗也会相应导致MT的表达增加。

1.5凋亡调控基因表达失控 顺铂诱导的细胞凋亡依赖于凋亡信号通路的正常表达[29],耐药相关基因的改变可导致细胞对凋亡信号的敏感性降低[30]。Bcl-2基因是一种细胞凋亡抑制基因,80%鼻咽癌中检测到Bcl-2蛋白的异常过表达[31],Bcl-2基因过表达可抑制顺铂诱导的细胞凋亡,从而使鼻咽癌细胞产生耐药[32]。YUAN等[33]研究发现,miR-125b可通过调节抗凋亡因子Bcl-2的表达水平来逆转鼻咽癌细胞对顺铂的耐药。可见,Bcl-2的高表达是导致其细胞凋亡受抑制的原因之一。抑癌基因p53作为一种重要的G2/M期检查点蛋白,通过阻断p53功能而调控G2期检查点基因表达而使肿瘤细胞对化疗药物敏感[37]。当p53基因发生突变时,顺铂诱发的细胞凋亡受到抑制,致使鼻咽癌细胞对顺铂的耐受明显增强[35]。MAPK通路已被证明在介导鼻咽癌对顺铂的敏感性发面发挥一定的作用。LIU等[36]通过Western blotting检测鼻咽癌细胞Rsf-1、Ras、MEK1、ERK1/2等蛋白水平,并通过移植瘤实验探讨RNA核旁斑组装转录本1(NEAT1)在裸鼠体内生长中的作用,发现NEAT1/let-7a-5p轴通过靶向Rsf-1和调节Ras-MAPK信号通路调控鼻咽癌顺铂耐药。MIAO等[37]建立HNE-1/DDP和CNE-2/DDP两株耐顺铂鼻咽癌细胞系,通过体外评价IAP-1对顺铂耐药鼻咽癌细胞增殖、凋亡、耐药性及相关细胞信号的影响,发现沉默IAP-1可诱导caspase-3上调,增强顺铂的抗增殖和促凋亡作用。

1.6外泌体与化疗耐药 肿瘤微环境中的外泌体在肿瘤细胞增殖、转移和耐药等方面均具有一定作用。外泌体作为媒介使肿瘤细胞产生耐药,其机制主要是在耐药细胞与敏感细胞之间进行信号传递,在鼻咽癌中,外泌体通过向靶细胞递送生物分子(如非编码RNA和蛋白质)[38],操纵肿瘤微环境,鼻咽癌耐药细胞内的外泌体可诱导敏感细胞对顺铂产生耐药[39]。LI等[40]研究发现,顺铂耐药CNE1细胞含有外泌体miR-106a-5p,将信号传递给顺铂敏感的CNE1细胞,miR-106a-5p与ARNT2的3'UTR结合,ARNT2的下调增加了AKT磷酸化,证实miR-106a-5p通过调节ARNT2 /AKT抑制鼻咽癌细胞凋亡,促进顺铂耐药性。

2 逆转鼻咽癌顺铂耐药的策略

2.1西药逆转耐药 体外试验证明,药物能逆转鼻咽癌细胞顺铂耐药。YIN等[41]发现氯喹能降低HNE-1/DDP细胞中P-gp、ABCB1、ABCC1的表达水平,与顺铂联合应用在裸鼠移植瘤模型中显示出明显的抗肿瘤作用。CHEN等[42]分别用顺铂、塞来昔布及两者联合处理鼻咽癌TW03细胞、TW03/DDP细胞和TW03/DDP-siRNA细胞,结果顺铂与塞来昔布联合应用在诱导TW03细胞和TW03/DDP细胞凋亡方面具有协同作用。SUN等[43]用300 Gy射线照射人鼻咽癌CNE-1细胞,然后用顺铂、二甲双胍及两者联合处理。结果表明,单药二甲双胍能够抑制受照射的CNE-1细胞的生长并诱导其凋亡,与顺铂有协同作用;此外,二甲双胍可下调PECAM -1,而PECAM -1可以调节多药耐药相关蛋白(MRPs )的表达。PPAR-γ激动剂罗格列酮对人鼻咽癌CNE-1/DDP细胞顺铂耐药性有逆转作用,且呈剂量依赖性,其原因可能与其抑制Akt磷酸化和耐药基因MDR1、MRP表达有关[44]。

2.2中药活性成分逆转耐药 目前,中药抗肿瘤多药耐药是众多学者专家研究的主流。我国中医药资源丰富,从中寻找低毒高效的耐药逆转剂具有相当大的潜力。近年来,随着提取与分离技术的逐渐成熟,中药活性成分逐渐成为有效的细胞毒性药物耐药的逆转剂。WEI等[45]研究设计合成8种含噻吩基团的苦参碱衍生物,并分别检测8种化合物对鼻咽癌细胞和顺铂耐药的鼻咽癌细胞 (CNE-2/DDP)的细胞毒性和初步协同作用,其中化合物3f通过下调抗凋亡蛋白Bcl-w对CNE-2/DDP细胞增殖起到抑制作用。人参多糖不仅能有效提高人体免疫力,同时还具有良好的抗肿瘤作用,其通过β-catenin信号转导途径诱导CNE-2凋亡,对耐顺铂人鼻咽癌细胞有着显著逆转作用[46]。异长春花碱属于长春碱类阻止细胞分裂的细胞周期特异性抗肿瘤药物,可逆转CNE-2/DDP细胞对顺铂的耐药性,降低细胞中MDR1、MRP1的表达,其机制可能与抑制c-Jun N-terminal protein kinase (JNK)磷酸化、下调AP-1活性有关[47]。和厚朴酚可部分逆转CNE-2/DDP细胞对顺铂耐药,其逆转CNE-2/DDP细胞耐药性的可能机制之一是通过下调Bcl-2 mRNA的表达,诱导细胞凋亡的发生,增加CNE-2/DDP细胞对化疗药物的敏感性[48]。康莱特注射液的成分为薏苡仁油,不同浓度的康莱特注射液呈浓度依赖性地抑制人鼻咽癌细胞CNE-2和CNE2/DDP细胞的增殖,且可逆转人鼻咽癌CNE-2/DDP细胞的耐药性,其机制可能与康莱特注射液能够抑制P-gp蛋白的表达、增加Cleaved Caspase-3蛋白的表达有关[49]。HSIEH等[50]发现五环三萜类雷公藤红素通过ERK1/2和p38MAPK信号通路诱导顺铂耐药的鼻咽癌细胞凋亡。

3 总结与展望

顺铂是临床治疗鼻咽癌的主要化疗药物,但在治疗过程中产生的耐药性使其疗效受到影响。顺铂的耐药机制较为复杂,笔者主要从DNA损伤修复能力的增强、药物外排增加及摄取减少、药物体内灭活、凋亡调控基因表达失控方面阐述了鼻咽癌顺铂耐药的机制。相关基因ERCC1、XRCC1可以预测顺铂化疗敏感性,个体化治疗方案可根据上述基因的表达水平进行制定,而对一些生物标志物及相关蛋白MRP、P-gp、CTR1、OCT2等深入研究有望成为解决顺铂耐药问题。目前,为规避鼻咽癌患者顺铂耐药,西医临床上能采用的药物治疗手段主要为联合化疗或者免疫治疗,单纯逆转顺铂耐药的药物大多还处于体外研究阶段,未来仍需进一步研究更多逆转鼻咽癌化疗顺铂耐药的药物,使顺铂在鼻咽癌患者中发挥更好的应用价值。