干眼动物模型建立与研究进展

陈 鹏，孔欢欢，桂 煜，孙丽娟

空军军医大学西京医院眼科，陕西 西安 710032)

干眼是一种由多因素引起泪膜不稳定、眼表结构状态异常的慢性疾病。我国5～89岁人群的干眼患病率为13.55%，约1.7亿人受到此病困扰，有干眼症状的人群大约有3.9亿，占人口总数的31.40%[1]。由此可见，干眼已逐渐成为亟待解决的眼科常见病之一。

覆盖在角膜表面的3层泪膜结构(脂质层、水液层、黏蛋白层)是维持屈光状态，湿润保护角膜和结膜上皮，使其避免受到感染、外伤和环境刺激，维持眼表微环境稳态的关键。眼部结膜、角膜上皮、泪腺、睑板腺、神经以及组织中的炎症因子和免疫细胞通过影响泪膜的稳定性和完整性，引起炎性细胞浸润、组织结构损伤和角膜神经异常等病理改变，使眼表微环境遭到破坏，发生干眼[2]。

由于干眼的多因素致病特征，本文按照干眼的临床特征分类，将干眼动物模型分为水液缺乏型、蒸发过强型和混合型三类[3]。水液缺乏型是通过泪腺切除、动物先天性泪腺功能障碍、动物自身免疫性疾病、神经阻滞、全身或者局部应用药物等方式影响泪腺分泌功能建立模型；蒸发过强型主要通过烧灼睑板腺口、干燥环境应激、局部应用药物破坏泪膜脂质层和黏蛋白层引起泪膜动力学异常诱导干眼体征；实验中通常在泪液缺乏动物的基础上进行干燥环境应激、局部应用药物或去势手术等方式建立模型，这种以两种方式建立的称为混合型干眼模型。

1 水液缺乏型干眼模型

1.1 泪腺的切除与损毁

不同实验动物泪腺构造存在种属差异，泪腺切除后泪液的分泌量、眼表炎症的持续时间和模型的可逆性均不一致。MECUM等[4]研究发现雌性小鼠的角膜更容易受到泪腺切除影响。SHINOMIYA等[5]在眶外泪腺切除的小鼠模型基础上，摘除眶内泪腺，使得模型的干眼体征更加明显。FAKIH等[6]利用切除泪腺建模研究参与干眼相关疼痛发展的外周致敏和神经炎症反应，有助于识别减轻眼部疼痛的新分子。

ROCHA等[7]通过8 Gy连续辐射5 d成功诱导小鼠干眼。与切除小鼠泪腺不同，此类模型在辐照结束2个月后，变薄的角膜上皮恢复，角膜基质增厚等炎性体征可逐渐消失。如果在小鼠接受辐照前，将腺病毒载体介导的促红细胞生成素基因转移到小鼠唾液腺进行预处理，发现干眼体征和角膜损伤得到恢复[7]。完全切除兔的泪腺(主泪腺、第三眼睑上腺和哈氏腺)，干眼体征稳定持续[8]，而部分切除兔的泪腺并不给予额外干预，泪液分泌代偿性增加，干眼体征和角膜炎症反应在4个月内逐渐好转[9]。这种干眼模型因其可逆性常用于治疗药物的开发。

1.2 泪腺神经功能障碍

泪腺分泌泪液需要正常的神经支配、充足的血液循环和腺体结构与功能完整。神经阻滞模型可以通过阻断神经传导来抑制泪腺分泌。

有学者使用射频探针损毁兔的三叉神经节[10]或经颞下岩前入路切除兔单侧眼岩浅大神经[11]，阻断眼表神经支配，实验眼出现结膜杯状细胞密度减少和角膜上皮糖原水平降低等干眼体征。但此种方法对手术操作有较高的要求，且低等动物神经修复能力大于人类，因此采用这种方法建立模型应考虑与人相近的大型哺乳动物。除手术干预，将肉毒杆菌素(botulinum toxin，BTX)注射到动物泪腺部位，可以阻断神经肌肉接头和胆碱能神经连接处乙酰胆碱的释放。在手术显微镜观察下，将1.25 mU的BTX-B注射至CBA/J小鼠泪腺持续3 d，小鼠泪液分泌量减少，有助于研究人类慢性干眼发病机制[12]。

抗胆碱药物是毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M受体)的竞争性拮抗剂，通过阻断乙酰胆碱的作用，抑制副交感神经系统，抑制腺体分泌。在6周龄的雌性Lewis大鼠中[13]，皮下植入东莨菪碱渗透泵诱导干眼，可见大鼠泪液分泌量减少，角膜上皮点状缺损等明显的干眼体征。AICHER等[14]在雄性SD大鼠皮下注射1 g/L甲基阿托品(1 mg/kg)，2次/d，连续2 d即可建立模型。该类干眼模型建立快速、简便，但阿托品、东莨菪碱等抗胆碱药物有一定毒副作用，对药物剂量和用药间隔时间有严格的要求。目前这种模型已广泛用于评估人工泪液或眼部外用药物的安全性。

Neurturin是一种副交感神经元的神经营养因子，Neurturin-deficient(NRTN-/-)转基因小鼠表现为与人干燥性角膜结膜炎相似的体征[15]。与同年龄的正常小鼠相比，NRTN-/-小鼠的泪液分泌量，泪膜破裂时间和角膜反射明显降低，结膜黏蛋白和杯状细胞密度均低于正常小鼠。该模型在研究泪腺自主感觉神经网络维持眼表健康方面有一定意义。

1.3 药物影响泪腺分泌

T细胞有丝分裂原刀豆蛋白是一种植物血凝素，具有强力的促有丝分裂作用，HONKANEN等[16]将其注射于兔双侧主泪腺，发现兔眼泪液分泌减少，眼表炎症反应明显，泪腺结构发生严重破坏，可建立稳定的干眼模型[17]。

ZOUKHRI等[18]在小鼠泪腺中注射IL-1，抑制泪腺分泌功能，使泪液分泌减少、泪腺腺泡上皮细胞破坏、炎症反应明显，建立一种可逆的泪液缺乏型干眼动物模型。

1.4 自主免疫影响泪腺功能

该类动物模型一般通过特定的基因编辑技术诱导突变，导致自身免疫失衡，外分泌腺中大量炎性细胞浸润，使泪腺功能受损，泪液分泌量减少，出现干眼体征，是模拟人类自身免疫性干眼的理想模型，但该类模型同时伴有其他器官或系统的损伤，造模时间一般较长(表1)。

表1 自身免疫性疾病相关的干眼症模型

NOD小鼠是由MAKINO等[19]开发的1型糖尿病小鼠模型，16周龄以上的NOD小鼠患自身免疫性胰岛素依赖型糖尿病，外分泌腺中炎性细胞浸润，泪腺分泌功能受损，泪液减少。12～16周龄NOD小鼠泪腺中，IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、IFN-γ、TNF-α等水平明显增加，与人类自身免疫性干眼中炎性因子的类别相似[20]。雄性NOD小鼠的自身免疫性泪腺炎发病率较高，可能与性激素水平有关。因此NOD小鼠是研究性别相关的原发性自主免疫性干眼的理想模型[21]。但伴有1型糖尿病的NOD小鼠需要长期注射胰岛素，增加饲养成本，还可能影响实验结果，为进一步排除糖尿病对造模的影响，ROBINSON等[22]建立了一种NOD小鼠衍生的B10.H2b小鼠模型，仅出现外分泌腺淋巴细胞浸润功能障碍而没有糖尿病症状。

MRL/lpr小鼠是一种系统性红斑狼疮动物模型，与NOD小鼠模型不同，雌性MRL/lpr小鼠的泪腺炎症严重程度明显高于雄性小鼠，表现为泪液分泌减少，泪腺中淋巴细胞浸润，有抗SSA和抗SSB抗体产生[23]，有学者发现，将p38-MAPK抑制剂SB203580注射到泪腺中可改善泪腺分泌功能。证实p38-MAPK途径在MRL/lpr小鼠干眼模型中起着重要作用[24]。

RbAp48转基因小鼠中视网膜母细胞瘤相关蛋白48是控制细胞生长和凋亡的一种多功能蛋白质分子，ISHIMARU等[25]研究发现RbAp48转基因鼠的泪腺上皮细胞出现特异性凋亡，影响泪腺分泌功能，敲除RbAp48基因，可抑制泪腺细胞凋亡。切除小鼠卵巢后，凋亡的泪腺上皮细胞中RbAp48的表达量增加，这提示RbAp48在雌激素缺乏介导的干眼中起一定作用。RbAp48转基因小鼠是研究泪腺上皮细胞凋亡的理想模型，但该模型完全依赖于人工过表达RbAp48，与人类干眼的自然病程不符。

Aire-/-小鼠，由于常染色体隐形基因Aire基因突变出现肾上腺皮质功能不全，甲状旁腺功能减退、慢性皮肤感染，以及眼部并发症。还表现为许多眼部并发症[26]。如泪液分泌减少，泪腺大量的淋巴细胞浸润及角膜新生血管增加等[27]。Aire-/-小鼠是研究自身免疫性干眼机制的常用模型。在IL-1受体拮抗剂治疗自身免疫性干眼和乳蛋白促进泪液分泌疗效方面的研究中已广泛应用[28]。

研究人员建立了其他具有干眼症状的自主免疫性小鼠模型。Aly/aly小鼠的常染色体隐性基因纯合子突变出现淋巴组织发育不全，泪腺发生以CD4+T细胞浸润为主的慢性炎症变化[29]。IQI/Jic小鼠与NFS/sld小鼠和其他自主免疫模型相比，需在培育过程中切除小鼠胸腺建立干眼模型，对出生3 d的IQI/Jic小鼠切除胸腺，小鼠在16周出现泪腺病变[30]。NFS/sld小鼠出生3 d后行胸腺切除术，外分泌腺出现以CD4+T细胞为主的淋巴细胞浸润[31]。

NZB/WF1小鼠和BXSB/MpJ-Yaa小鼠是系统性红斑狼疮动物模型，疾病累及泪腺，可出现典型的干眼症状。雄性BXSB/MpJ-Yaa小鼠因Y染色体上的Y连锁自身免疫加速突变使得干眼症状更为严重[32]。Id3KO小鼠唾液和泪液的分泌明显减少[33]，是一种细胞和体液免疫共同参与疾病的模型。PI3KKO小鼠胸腺细胞发育不良，出现角膜损伤，泪腺腺泡结构破坏，导管直径变粗，伴有以CD4+T细胞为主的淋巴细胞浸润[34]。Act-1-/-小鼠泪腺中存在严重的B220+细胞、CD4+T和CD8+T细胞浸润，破坏泪腺的分泌功能[35]。CD25KO小鼠泪腺中Th1和Th17因子增加导致泪腺萎缩纤维化[36]。TSP-1KO小鼠泪腺CD4+T细胞浸润，上皮细胞凋亡坏死[37]。

这些模型外分泌腺中出现严重的淋巴细胞浸润，唾液和眼泪的分泌量明显减少，均可作为一种干眼模型来研究人类自身免疫性干眼。

2 蒸发过强型干眼动物模型

蒸发过强型干眼动物模型，一般是通过诱导眼表炎症影响泪膜稳定性建立模型。

睑板腺分泌脂质形成了泪膜脂质层，可稳定泪膜，灼烧封闭兔睑板腺口，间接破坏泪液脂质层可促进泪液的蒸发，泪膜破裂时间减少，泪液渗透压增高，结膜杯状细胞和角膜上皮糖原减少，出现典型干眼体征[38]。JIN等[39]认为1-25-二羟基-22-氧骨化三醇作为一种临床上用于治疗银屑病的维生素D3类似物，可缓解睑板腺萎缩和导管扩张，提示维生素D及其类似物在维持眼表健康方面起着重要作用。MIYAKE等[40]将完全弗氏佐剂(灭活的结核分枝杆菌)分别注射到兔鼻侧、中部和颞侧上眼睑边缘，建立睑板腺功能障碍(meibomian gland dysfunction，MGD)模型，两周后出现干眼体征。有学者对大鼠、兔眼局部应用高浓度肾上腺素或全身应用异维A酸，异维A酸通过PPAR-γ途径，影响睑板腺细胞分化，睑板腺导管口上皮过度角化、建立MGD模型[41-42]。载脂蛋白C1转基因小鼠[43]和ACAT-1-/-小鼠[44]等转基因动物模型，有不同程度睑板腺功能异常，引发眼表慢性炎症。

使用开睑器或缝线固定眼睑或者将小鼠在低湿度气流持续暴露，出现泪液分泌量减少和角膜点状溃疡，暴露时间越长，角膜干燥斑越明显。而将湿度控制恒定，环境温度升高时，小鼠泪膜破裂时间也会下降[45]。这在生物学和形态学变化方面与人类干眼相似，且较为容易建立模型。

局部应用药物也可破坏泪膜稳定。苯扎氯铵作为滴眼液中常用的防腐剂能够影响泪膜稳定、结膜杯状细胞缺失、结膜鳞状化生[46]。可利用高浓度苯扎氯铵建立干眼模型。李晶等[47]用高渗盐水局部滴小鼠眼，可见泪液分泌量减少，角膜上皮基底部细胞排列紊乱缺失，出现空泡，引起类似干眼的病理损害，为探索泪液高渗透压导致干眼的机制提供思路。

有研究认为空气污染指数的升高会增加干眼症的发病率，LI等[48]用大气污染物制备的滴眼液诱导建立干眼动物模型，将5.0 g/L PM10滴眼液滴小鼠眼，4次/d，持续14 d，小鼠角膜上皮增厚，伴有细胞损伤和脱落，角膜表面光滑度降低，角膜上皮微绒毛缩短无序。使用颈部约束器将大鼠暴露于约500 μg/m3城市污染物中[49]，5 h/d，连续5 d，可诱导大鼠角膜上皮细胞凋亡，结膜杯状细胞减少，破坏泪膜粘蛋白层。

3 混合型干眼动物模型

有学者将干燥应激与药物干预结合建立干眼模型，将小鼠暴露在干燥环境中，同时皮下注射东莨菪碱，小鼠泪腺分泌量减少、角膜荧光染色异常、结膜杯状细胞和角膜上皮细胞凋亡、炎症因子水平增加，干眼体征稳定，而被广泛应用[50]。

LI等[51]将兔泪腺完全切除的基础上用50 g/mL三氯乙酸烧灼角膜，泪液减少直接损害了结膜的杯状细胞，破坏了泪膜黏蛋白层。造模更迅速，干眼体征更明显。

维生素是调节眼的发育和眼表正常分化的重要营养物质[52]。对兔进行维生素A完全缺乏饲料喂养6个月，实验组兔体质量较轻，毛发粗糙，角膜干燥无光泽，可见灰白色溃疡灶，泪液分泌量减少，成功建立干眼模型。在此模型中NF-κBp65、NOS2过表达，可能参与干眼的发生。

SINGH等[53]将雌性Wistar大鼠双侧卵巢切除，发现泪液分泌量减少，出现干眼体征。LI等[54]对雌性Wistar大鼠非那雄胺胃灌注4周，泪腺中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、Fas-L和TNF-α等炎性因子升高，泪液分泌量减少，同时发生MGD，建立一种由雄激素缺乏诱导的干眼模型。抗雄激素动物模型产生明显的干眼体征，可用于了解绝经后和雄激素缺乏干眼的疾病过程。

年龄是干眼的重要危险因素，有学者发现12月龄以上的C57BL/6小鼠睑板腺功能异常，泪腺中MMP-9过表达、炎症因子增加、CD4+T和CD8+T细胞浸润，可作为研究年龄相关慢性干眼的模型[55]。

4 讨论

目前基于多种实验动物建立的干眼模型类型较多，除常规实验动物外，有学者基于探索人类PAX6突变的斑马鱼角膜模型[56]，提出有将斑马鱼等新型实验动物开发成干眼动物模型的可能。实验研究中应根据干眼的严重程度与病理生理学机制的不同正确选择干眼动物模型。一般来说，泪液缺乏型干眼模型多通过阻碍泪腺分泌功能来建立。泪腺切除术(切除瞬膜和哈德氏腺)、泪腺神经阻滞，可引起严重的泪液分泌障碍，但需要高水平的手术技术并熟悉实验动物解剖。局部应用化学药品，可迅速建立模型，不过这些不能完全模拟自主免疫性干眼。自身免疫性疾病动物模型表现为包括泪腺损伤在内的多器官炎症病变，泪腺中有明显淋巴细胞浸润[57]。蒸发过强型干眼模型可通过睑板腺功能障碍实现，部分转基因鼠，ACAT-1KO小鼠、TRAF6KO小鼠、Barx2KO小鼠，表现为睑板腺的异常发育，发生MGD[58]。也有学者利用烟草烟雾[59]和大气污染物等建立干眼模型，用以研究环境因素对干眼疾病发展的影响。干眼在女性的患病率高于男性，雄激素对泪腺及睑板腺分泌功能有调控作用，将雄性大鼠睾丸摘除[60]，睑板腺和泪腺上皮细胞萎缩，泪液分泌量持续降低，泪膜破裂时间缩短，角膜荧光异常。

当前，干眼动物模型的研究进展迅速，许多治疗药物开发正是基于这些干眼动物模型得到重要结果。但是人类干眼发病涉及复杂的病理生理机制和免疫反应，没有哪种干眼动物模型可以作为研究的最佳工具，需要我们建立更全面、更精细的干眼模型来分析干眼发病机制，寻找治疗的新靶点。