茵陈蒿汤对代谢相关脂肪性肝病小鼠“肠TPH1-肝HTR2A轴”的影响＊

黄艳阳，隋国媛，赵 娜，杨关林，贾连群

（1. 辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室 沈阳 110847；2. 辽宁中医药大学研究生学院 沈阳 110847；3. 辽宁中医药大学中西医结合学院 沈阳 110847）

代谢相关脂肪性肝病（Metabolic associated fatty liver disease，MAFLD），曾用名非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）在全球成年人中患病率为22.10%-28.65%，在中国成年人中患病率为17.95%-22.31%，且呈逐年升高趋势[1-3]。MAFLD不仅会导致肝病残疾和死亡，也会造成心血管疾病、糖尿病等疾病的发病率升高[4-5]。湿热蕴结证是MAFLD 常见中医证候[6-7]，清热祛湿中药茵陈蒿汤防治MAFLD 疗效确切[8-9]。茵陈蒿汤最早载于《伤寒论》，茵陈具有清热利湿、疏利肝胆功能；栀子具有清泄三焦湿热功能；大黄具有通利大便，导热下行功能，三药合用，湿去热除。已有研究发现茵陈蒿汤可通过调控脂质代谢、氧化应激、炎症反应等途径抑制MAFLD 发生发展[8]。文献报道湿热证与5-羟色胺（5-hydroxytrypatamine，5-HT）代谢紊乱密切相关[10]，清热祛湿法可调控5-HT代谢紊乱[11]。体内约95%的5-HT由肠嗜铬细胞合成、分泌，色氨酸羟化酶1（Ryptophan hydroxylase-1，TPH1）为肠嗜铬细胞合成5-HT 的限速酶，调控5-HT 浓度[12]。最新研究发现肠源性5-HT 调控5-羟色胺受体2A（5-hydroxytryptamine receptor 2A，HTR2A）介导的肝脏甘油三酯合成促进NAFLD 发生发展[12-14]。由此推断，茵陈蒿汤可能通过此信号通路发挥防治MAFLD 作用。本研究以MAFLD 小鼠为研究对象，探讨茵陈蒿汤对肠TPH1-肝HTR2A 轴的影响，为临床中西医结合防治MAFLD 提供新的研究策略及科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24只SPF级雄性C57BL/6J小鼠，5-6周龄，18-22 g，购买于北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK（京）2019-0008]。通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准，于辽宁中医药大学实验动物中心饲养。

1.2 实验药品

茵陈蒿汤的组成：茵陈18 g，栀子9 g，大黄6 g；购买于辽宁中医药大学附属医院，煎煮后生药量为0.495 g·mL-1。

1.3 主要仪器

正置光学显微镜（日本尼康，Nikon Eclipse E100）；全自动生化分析仪（日本日立，型号7180）；多功能酶标仪（Thermo 公司，型号1510）；实时荧光定量PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司，型号7500）；化学发光成像系统（上海天能科技有限公司，型号Tanon-5200）。

1.4 主要试剂

TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST 测定试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司提供，产品批号分别为202110412、202202012、20210612、20210312、20210422、20210512）；苏木素-伊红染液（Servicebio 提供，产品货号为G1003）；RT-qPCR 试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，产品货号为CW2601M）；PKC-ε 抗体（武汉三鹰，20877-1-AP）；HTR2A、SREBP-1c 抗体（absin 公司提供，产品货号分别为abs120613、abs152294）；TPH1、SERT、GPAT1 抗体（Bioss 公司提供，产品货号bs-1215R、bs-1893R、bs-5063R）。

1.5 模型制备、分组及给药方式

24 只小鼠随机分为对照组、模型组和茵陈蒿汤组，每组8只。对照组给予基础饲料，模型组及茵陈蒿汤组给予高脂饲料[小黍有泰（北京）生物科技有限公司提供，产品货号：2021070030]。前期研究表明茵陈蒿汤中剂量（按实验动物与人体体表面积比等效量计算动物等效剂量）改善MAFLD 优于低剂量和高剂量，高剂量茵陈蒿汤可增加肝毒性[15-16]，因此本研究选用茵陈蒿汤中剂量。12周后灌胃给药，茵陈蒿汤组给予茵陈蒿汤（每天0.3 mL）灌胃，正常组与模型组给予等体积的生理盐水灌胃，灌胃4周。

1.6 指标检测

1.6.1 血脂和肝功能检测

采用随机数表法每组选取6只小鼠。全自动生化分析仪对血清TC、TG、AST、ALT、LDL-C、HDL-C 含量进行检测。

1.6.2 肝脏组织HE染色

4%多聚甲醛固定肝脏组织24 h 以上，石蜡切片脱蜡至水、苏木素染色、伊红染色、脱水封片、显微镜镜检后采集图像进行分析。

1.6.3 肝脏组织油红O染色

取小鼠肝脏组织制备新鲜冰冻切片后固定，切片入油红染液浸8-10min（加盖避光）染色，依次浸入两缸60%异丙醇各3 s、5 s 分化，两次纯水浸洗，取出切片停留3 s 后浸入苏木素复染3-5 min，三次浸洗，各5 s、10 s、30 s。60%乙醇为溶剂分化2-8s，2 缸蒸馏水水洗各10 s，返蓝液返蓝1 s，纯水浸洗2次，各5 s、10 s，甘油明胶封片剂封片，显微镜镜检，图像采集分析。

1.6.4 ELISA法检测含量

采用随机数表法每组选取6只小鼠。根据试剂盒说明书检测小鼠血清5-HT、肝脏TC、TG、二酰基甘油（diacylglycerol，DAG）、磷脂酶C（phospholipase C，PLC）含量。

1.6.5 Western blot检测蛋白表达情况

采用随机数表法每组选取3 只小鼠，检测小肠TPH1、5- 羟色胺转运蛋白（Serotonin reuptake transporter，SERT）及肝脏HTR2A、蛋白激酶C-ε（Protein kinase C-Epsilon，PKC-ε）、磷酸化磷脂肌醇3激酶（Phosphorylated phosphoinositide 3-kinase，PPI3K）、磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylated protein kinase B，P-AKT）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（Phosphorylated mammalian target of rapamycin，PmTOR）、固醇调节元件结合蛋白-1c（Sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、甘油-3-磷酸酰基转移酶1（Glycerol-3-phosphate acyltransferase 1，GPAT1）、脂肪酸合酶（Fattsynthase，FASN）。称取小鼠肝脏组织0.1 g 后，加入1 mL 含PMSF 的RIPA 裂解液，于冰上充分研磨后，冰上静置30 min，离心取上清。使用BCA 试剂盒检测各组蛋白浓度后，制备样品，计算出每个样本的上样体积后进行电泳操作。电泳后，封闭，一抗4℃孵育过夜，洗膜，二抗，洗膜，曝光，分析灰度值。

1.6.6 RT-qPCR检测mRNA水平

采用随机数表法每组选取6 只小鼠，检测小肠TPH1、SERT 及肝脏HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA水平。称取小鼠肝脏组织0.1 g后，TRIzol法提取总RNA，测定RNA 浓度，稀释为200 ng·μL-1后，在冰上配置反应体系后，反转录为cDNA，按照说明书采用SYBR Green 进行实时荧光PCR。结果用△△Ct 法进行相对定量分析，用2-△△Ct表示。引物序列见表1。

1.6.7 统计学方法

应用Prism 8.4.0 软件进行统计分析，计量资料结果以均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用ANOVA分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肝脏HE和油红O染色病理特征

由图1所示，对照组肝细胞排列整齐，无明显脂肪变性；模型组肝细胞体积肿胀，有明显脂肪变性；与模型组比，茵陈蒿汤组肝细胞脂肪变性显著减少。由图2所示，相较于对照组，模型组肝脏脂质沉积显著升高，茵陈蒿汤显著改善肝脏脂质沉积。

图1 各组小鼠肝脏HE染色结果（200×）

图2 各组小鼠肝脏油红O染色结果（200×）

2.2 各组小鼠肝脏TC、TG、DAG、PLC含量

由表2 所示，相较于对照组，模型组肝脏TG 和TC水平显著升高（P<0.05）；相较于模型组，茵陈蒿汤组肝脏TG和TC水平显著降低（P<0.05）。

表2 各组小鼠肝脏TC、TG、DAG、PLC含量（±s，n=6）

表2 各组小鼠肝脏TC、TG、DAG、PLC含量（±s，n=6）

注：与对照组比，*P<0.05；与模型组比，#P<0.05。

PLC 42.95±0.45 52.86±1.46*47.20±1.08#组别对照组模型组茵陈蒿汤组TG（mmol·L-1）0.08±0.03 0.26±0.12*0.14±0.04#TC（mmol·gprot-1）0.02±0.003 0.03±0.012*0.02±0.004#DAG（ng·mL-1）17.72±0.41 21.56±1.99*18.20±1.14#

2.3 各组小鼠肝功能、血脂水平

由表3 所示，相较于对照组，模型组血清AST、ALT、HDL-C、LDL-C、TG、TC 水平显著升高（P<0.05）；相较于模型组，茵陈蒿汤组血清AST、ALT、LDL-C、TG水平显著降低（P<0.05）。

表3 各组小鼠肝功能、血脂特征（±s，n=6）

表3 各组小鼠肝功能、血脂特征（±s，n=6）

注：与对照组比，*P<0.05；与模型组比，#P<0.05。

TC（mmol·L-1）)2.67±0.53 4.13±0.42*4.09±0.43*组别对照组模型组茵陈蒿汤组AST（U·L-1）94.07±27.08 165.30±40.31*89.20±13.73#ALT（U·L-1）35.05±5.94 45.90±12.60*29.57±3.69#HDL-C（mmol·L-1）1.42±0.35 2.15±0.20*2.20±0.22*LDL-C（mmol·L-1）0.20±0.05 0.27±0.04*0.22±0.03#TG（mmol·L-1）0.95±0.24 1.16±0.10*0.84±0.15#

2.4 各组小鼠血清5-HT含量比较

由表4 所示，相较于对照组，模型组血清5-HT 水平显著升高（P<0.05）；与相较于模型组，茵陈蒿汤组血清5-HT水平显著降低（P<0.05）。

表4 各组小鼠血清5-HT特征（±s，n=6）

表4 各组小鼠血清5-HT特征（±s，n=6）

注：与对照组比，*P<0.05；与模型组比，#P<0.05。

5-HT（ng·mL-1）234.49±12.53 261.62±22.95*224.43±9.94#组别对照组模型组茵陈蒿汤组

2.5 各组小鼠小肠TPH1、SERT mRNA水平

由表5 所示，相较于对照组，模型组小鼠小肠TPH1 mRNA 表达水平显著升高，SERT mRNA 表达水平显著降低（P<0.05）；茵陈蒿汤干预后，相较于模型组，小肠TPH1 mRNA表达水平显著降低，SERT mRNA表达水平显著升高（P<0.05）。

表5 各组小鼠小肠TPH1、SERT mRNA水平（±s，n=6）

表5 各组小鼠小肠TPH1、SERT mRNA水平（±s，n=6）

注：与对照组比，*P<0.05；与模型组比，#P<0.05。

SERT 1.000±0.000 0.550±0.210*0.928±0.058#组别对照组模型组茵陈蒿汤组TPH1 1.000±0.00 1.573±0.045*1.292±0.070#

2.6 各组小鼠肝脏HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA水平

由表6 所示，相较于对照组，模型组小鼠肝脏HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA 表达水平显著升高（P<0.05）；茵陈蒿汤干预后，HTR2A、SREBP-1C、GPAT1、FASN mRNA表达水平显著降低（P<0.05）。

表6 各组小鼠肝脏HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA水平（±s，n=6）

表6 各组小鼠肝脏HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA水平（±s，n=6）

注：与对照组比，*P<0.05；与模型组比，#P<0.05。

FASN 1.000±0.000 3.000±0.373*2.063±0.325#组别对照组模型组茵陈蒿汤组HTR2A 1.000±0.000 2.770±0.245*2.052±0.207#SREBP-1c 1.00±0.000 3.576±0.830*2.150±0.202#GPAT1 1.000±0.00 2.400±0.589*1.480±0.150#

2.7 各组小鼠小肠TPH1、SERT蛋白表达

由图3 和表7 所示，相较于对照组，模型组小鼠肝脏TPH1 蛋白表达水平显著升高（P<0.05），SERT 蛋白表达水平显著下降（P<0.05）；茵陈蒿汤干预后，肝脏TPH1 蛋白表达水平显著下降（P<0.05），SERT 蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。

图3 各组小鼠小肠TPH1、SERT表达水平

表7 各组小鼠TPH1、SERT蛋白含量（±s，n=6）

表7 各组小鼠TPH1、SERT蛋白含量（±s，n=6）

注：与对照组比，*P<0.05；与模型组比，#P<0.05。

组别对照组模型组茵陈蒿汤组TPH1 0.94±0.013 1.18±0.008*1.01±0.008#SERT 1.13±0.100 0.93±0.130*1.03±0.130#

2.8 各组小鼠肝脏HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN蛋白表达

由图4 和表8 所示，相较于对照组，模型组小鼠肝脏 HTR2A、PKC- ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN 蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；茵陈蒿汤干预后，肝脏HTR2A、PKC-ε、PPI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN 蛋白表达水平显著下降（P<0.05）。

图4 各组小鼠肝脏HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN表达水平

表8 各组小鼠肝脏HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN蛋白含量（±s，n=6）

表8 各组小鼠肝脏HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN蛋白含量（±s，n=6）

注：与对照组比，*P<0.05；与模型组比，#P<0.05。

组别对照组模型组茵陈蒿汤组HTR2A 0.59±0.018 0.75±0.006*0.64±0.010#PKC-ε 0.91±0.016 1.28±0.018*1.18±0.013#P-PI3K 1.06±0.020 1.45±0.012*1.24±0.020#P-AKT 0.91±0.013 1.21±0.019*1.11±0.017#P-mTOR 0.90±0.015 1.10±0.012*1.00±0.017*SREBP-1c 0.64±0.006 0.98±0.006*0.85±0.012#GPAT1 0.64±0.038 1.00±0.078*0.81±0.017#FASN 0.97±0.002 1.25±0.012*1.07±0.006#

3 讨论

《湿热病篇》云：“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热”。湿热蕴结脾胃，阻碍中焦气机，气机升降失和，肝失疏泄，气血精津郁而变生他邪，由此可致肝系病证。MAFLD 发病多因劳逸失度、饮食失节、禀赋不足、情志失调、久病体虚等因素导致脾胃运化失调，湿热内生，气机升降失和，津血不行，化生浊毒闭阻肝脏[17]。清热祛湿中药茵陈蒿汤方中茵陈为君，归脾、胃、肝、胆经；栀子为臣，归肝、肺、胃、心、三焦经；大黄为佐，归胃、大肠、肝经。现代药理研究发现茵陈蒿汤具有调节血脂、保肝利胆等作用[17-18]。本研究发现，与对照组比较，模型组小鼠肝细胞体积肿胀，有明显脂肪变性，血清AST、ALT、LDL-C、TG、TC水平显著升高，肝脏TG、TC 水平显著升高，表明造模较为成功。与模型组比较，茵陈蒿汤组肝细胞脂肪变性显著减少，血清AST、ALT、LDL-C、TG 水平显著降低，肝脏TG、TC水平显著降低，提示茵陈蒿汤可有效改善MAFLD。

临床和动物研究表明5-HT 是MAFLD 的独立危险因素[19-21]。5-HT 产生受到色氨酸和TPH 的调节[22]，SERT 可以将其从间质空间摄取到上皮细胞终止其作用，降低SERT 的表达会减少5-HT 的灭活，蓄积的5-HT 可能会促进MAFLD 的发展。肠道特异性Tph1 基因敲除可抑制肠源性5-HT 合成，调控肝脏脂质代谢，5-HT 可分为中枢5-HT 与外周5-HT，二者的调控互不影响，体内约95%的5-HT 由外周肠嗜铬细胞合成分泌[20]。已有研究发现5-HT可促进肝脏TG合成[23-25]，5-HT合成抑制剂可显著改善高脂饮食诱导的肝脏TG蓄积[26]。本研究发现，与对照组比较，模型组血清5-HT、小肠TPH1以及肝脏TG水平显著升高，小肠SERT水平显著降低；与模型组比，茵陈蒿汤组血清5-HT、小肠TPH1 以及肝脏TG 水平显著降低，小肠SERT 水平显著升高，由此可见，茵陈蒿汤可能通过调控5-HT降低肝脏TG合成抑制MAFLD发生发展。

最新研究发现肠源性5-HT 调控HTR2A 介导的肝脏TG合成促进NAFLD发生发展[13-14]。5-HT受体的7 个亚家族中除5-HT3 受体外，其余均属于G 蛋白偶联受体超家族[26]。HTR2A 作为5-HT 受体之一，是5-HT 调控肝脏TG 合成促进MAFLD 发生发展的关键因子[13]。肝脏特异性HTR2A 基因敲除小鼠可显著抑制高脂饮食诱导的肝脏TG 蓄积，HTR2A 拮抗剂显著抑制5-HT 诱导的肝细胞TG 蓄积[12-13]。HTR2A 可通过DAG 启动PKC-ε 从而诱导肝脏TG 的合成，DAG 和PKC 被认为是具有信号传导功能的因子，DAG 是PKC的变构激活剂[27]。在MAFLD 大鼠模型中PKC-ε 的表达与PI3K的表达呈负相关，与肝脂肪变性的程度呈正相关[28]。DAG 在肝脏中的积累会导致PKC-ε 的激活从而降低PI3K 的含量，PI3K/AKT/mTOR 信号通路在肝脏脂代谢的平衡过程中起重要作用，PI3K 可以激活AKT 使之磷酸化，进而磷酸化其下游的mTOR 复合物1，激活主要的脂肪生成调节因子SREBP-1c，调控FFA、TG 代谢[29-31]。主要在肝脏和脂肪细胞中表达的SREBP-1c，是参与TG 合成基因的主要转录调节因子，SREBP-1c 过度表达会增加肝脏TG 合成[32]。SREBP-1c 是GPAT1 的主要转录调节因子，GPAT1 启动子区含有SREBP-1c的结合位点，SREBP-1c过表达可促进GPAT1 表达[32]。GPATs 作为TG 合成的限速酶，催化磷酸甘油与一分子脂酰辅酶A 生成1-脂酰基甘油-3-磷酸，是TG 生物合成的起始步骤[33]。目前发现在哺乳动物体内有4 种亚型，其中GPAT1 定位于线粒体外膜，其在肝脏和脂肪组织中高表达，基因过表达和敲除实验均表明GPAT1 在NAFLD 发生发展过程中发挥重要作用[34]。FASN 存在于胞质中，且FASN 的启动子区也存在SREBP-1c 转录因子的结合位点，在SREBP-1c 与其结合后，可以直接调控促进脂肪酸的从头合成途径，即由乙酰辅酶A 和丙二酰辅酶A 从头合成棕榈酸脂的催化步骤，促进肝细胞内脂质大量堆积从而促进MAFLD 的发生发展[35-36]。本研究发现与对照组比，模型组小鼠肝脏HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN 蛋白表达水平显著升高；茵陈蒿汤干预后HTR2A、PKC-ε、PPI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN 蛋白表达水平显著降低。由此可见，茵陈蒿汤可能通过调控5-HT/HTR2A信号通路降低肝脏TG合成。

综上所述，茵陈蒿汤可通过肠TPH1-肝HTR2A轴抑制肝脏TG 合成进而改善MAFLD，为临床中西医结合防治MAFLD提供新的研究策略及科学依据。