鱼类性别特异分子标记筛选及分子性控育种研究现状与展望

刘 洋，陈松林*

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室，山东 青岛 266071；2.山东省海洋渔业生物技术与遗传育种重点实验室，山东 青岛 266071；3.农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛 266071)

1 引言

中国是水产养殖大国，近二十年来，中国水产养殖产量一直占世界水产养殖总产量的三分之二左右，具有举足轻重的地位。鱼类是水产养殖的主体，鱼类养殖业是保障国家粮食安全的重要产业。2022 年我国水产养殖总产量5 565.46 万t，其中鱼类养殖产量2 903.04 万t，占水产养殖总产量的52.16%。培育养殖鱼类良种，提高单位水体的鱼类养殖产量，增加鱼类养殖收益，是践行“打好种业翻身仗”、实践大食物观、增加我国优质蛋白供应渠道与总量、提高我国食品安全指数和改善全民膳食结构的有效途径。

许多鱼类都存在典型的性别二态性现象，雌雄个体在生长速率上存在明显差异。如罗非鱼(Oreochromisspp.) 和黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)等淡水鱼类雄鱼比雌鱼生长速率快30%～200%，而大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)、鳜(Siniperca chuatsi)和半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)等鱼类的雌性个体比雄性个体生长快，特别是半滑舌鳎，其雌性个体生长速率比雄性个体快2～4 倍。因此，开展上述鱼类的性别控制研究，培育全雄(或全雌)苗种，进行单性养殖对于提高单位养殖产量具有重要意义。鱼类性别控制和单性养殖一直都是国际上的重要研究课题，而性别特异分子标记作为开展性别决定机制研究与性别控制的基础工具，始终是鱼类性别决定和性别控制研究中的前沿热点，国际上一直都在寻找不同鱼类性别特异的分子标记，并建立可靠的遗传性别鉴定方法。

自20 世纪90 年代以来，科学家纷纷采用限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、随机扩增多态性DNA 标记 (random amplified polymorphic DNA,RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)和简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)等不同的分子标记技术，尝试发掘鱼类性别特异分子标记。国外早期研究取得的进展主要包括Devlin 等[1]在大鳞钩吻鲑(O.tshawytscha)上开发出了Y 染色体特异的雄性特异标记，这是最早的鱼类性别特异分子标记的报道；Allendorf 等[2]通过差减杂交方法在虹鳟(O.mykiss)上获得了1 个雄性特异的DNA 片段；Iturra 等[3]用RAPD 技术和集团分离分析法(bulked segregant analysis,BSA)在虹鳟基因组中找到了2 个雄性特异的分子标记；Lee 等[4]用BSA 方法在尼罗罗非鱼(O.niloticus)上找到10 个与表型性别连锁的微卫星标记，这些标记可以用于不同Y 染色体等位基因功能的研究和具有1 个或者几个Y 染色体拷贝的亲鱼的鉴定；Griffiths 等[5]在三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)中找到了2 个雄性特异的AFLP 标记，但当应用于另外两种刺鱼时，却未能正确的鉴定其性别；Ezaz 等[6]用AFLP 技术扫描尼罗罗非鱼基因组，找到3 个Y 染色体连锁的AFLP 标记，然而这些标记却不能鉴别无亲缘关系的个体性别，表明这些标记并不是物种通用的雄性特异分子标记。

我国养殖鱼类多达200 余种，很多鱼类都存在性别二态性现象，具有单性育种的必要性，因此，鱼类性别特异分子标记筛选对于我国鱼类性别控制和养殖产业发展尤其重要。国内学者自20世纪初就开展了鱼类性别特异分子标记筛选的研究，目前，我国已在半滑舌鳎等三十多种养殖鱼类上筛选到性别特异分子标记，并建立了分子标记辅助性控技术，使我国在鱼类性别特异分子标记筛选上跻身国际前列。下面本文系统回顾一下我国鱼类性别特异分子标记筛选的研究历程、取得的重要进展及今后的发展方向。

2 我国鱼类性别特异分子标记研究历程

2.1 我国鱼类性别特异分子标记研究的探索期(2001—2006)

借鉴国外鱼类性别特异分子标记的研究经验，国内学者在不同鱼类上开展了相应的研究，尝试在养殖鱼类中找到性别特异分子标记。如常重杰等[7]利用40 种随机引物在2 种泥鳅的3 个地理群体雌雄各30 尾个体中未发现性别特异片段；宋平等[8]应用RAPD 在黄颡鱼中也没有找到性别特异的DNA 片段；李建中等[9]共采用了120 个随机引物，以雌、雄性异源四倍体鲫(Carassius auratus)、鲤(Cyprinus carpio)DNA 池为模板，同时进行RAPD扩增，发现有14 个重复性好、带型清晰明亮且雌雄群体有差异，但在进一步验证中，只有引物S129 在雌雄个体间存在差异。

2.2 我国鱼类性别特异分子标记筛选的突破期(2007—2012)

半滑舌鳎性别特异分子标记的发现 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)主要生活于我国的黄渤海海域，其肉味鲜美，营养丰富，深受消费者欢迎，市场价值高。但半滑舌鳎雌雄个体生长差异大，研究表明，2 龄雌性成鱼体重平均为同龄雄鱼的3.28 倍[10]，而在普通养殖群体中，雄鱼比例高达80%左右，这导致半滑舌鳎养殖产量降低、成本升高，影响了半滑舌鳎苗种的推广和产业的发展。因此，开展半滑舌鳎性别控制研究，提高雌鱼比例，对于半滑舌鳎养殖产业高质量发展具有重要意义。要进行性别控制，首先要能进行遗传性别鉴定，因此，筛选半滑舌鳎性别特异分子标记成为进行性别控制育种研究的重要前提。

半滑舌鳎雌性特异AFLP 标记的发现中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林团队，采用64 个AFLP 引物组合对半滑舌鳎雌雄鱼基因组进行了扫描，筛选到 7 个雌性特异的DNA 条带，并首次开发出半滑舌鳎雌性特异的AFLP 分子标记M1。随后，根据雌性特异AFLP 标记M1 的核苷酸序列设计一对引物，成功将M1 转化为SCAR 标记。使用研发的SCAR 标记分别扩增57个雌性和55 个雄性半滑舌鳎个体的DNA，在所有雌性个体中均扩增出一个特异的DNA 条带，而所有雄性个体中则未扩增出该条带，从而证明了黄海所开发的半滑舌鳎雌性特异标记与PCR 技术的有效性[11]，这也是我国发现的第一个鱼类性别特异分子标记。

半滑舌鳎性别特异微卫星标记的研发半滑舌鳎是ZW 型性别决定类型[12]。根据遗传学经典理论，半滑舌鳎雌鱼产生Z 型和W 型两种卵子，通过人工雌核发育可以生产ZZ 型雄和WW型超雌两种雌核发育鱼苗，将WW 超雌鱼苗培育成熟，然后与ZZ 雄鱼交配，即可大量生产ZW型全雌鱼苗。而要筛选培育WW 超雌个体，其前提是必须能鉴定出WW 超雌个体和普通ZW 雌性个体，因此半滑舌鳎WW 超雌个体的鉴定成为研制半滑舌鳎全雌鱼苗的关键。而中国水产科学研究院黄海水产研究所2007 筛选到的半滑舌鳎雌性特异AFLP 标记是一种显性遗传标记，尽管能区分ZZ 雄鱼和ZW 雌鱼，但难以区分ZW 雌和WW 超雌。因此，探索能够区分半滑舌鳎ZW 雌鱼和WW 超雌的分子标记，对于筛选和大量培育超雌个体，进而培育半滑舌鳎全雌苗种，具有重要意义。为此，中国水产科学研究院黄海水产研究所在完成半滑舌鳎全基因组测序和组装的基础上，对雌、雄鱼基因组序列进行比对发现了性别连锁的微卫星标记并进行了验证。结果表明，其中1 个微卫星标记CseF-SSR1 与半滑舌鳎性别紧密连锁，是性别特异微卫星标记。采用CseFSSR1 引物分别扩增性成熟的半滑舌鳎雌、雄鱼各12 尾，雌鱼可以扩增出2 个片段，而雄鱼只能扩增出其中1 个片段，因此，确定仅在半滑舌鳎雌性中扩增出的DNA 片段为W 染色体特异片段[13]。

采用上述微卫星标记对半滑舌鳎卵裂雌核发育孵出前胚胎进行鉴定，从39 尾异精卵裂雌核发育孵出前胚胎中检测到4 个只含有W 染色体片段胚胎，由此初步表明，在半滑舌鳎异精卵裂雌核发育孵出前胚胎中含有约10%的超雌个体。半滑舌鳎性别特异微卫星标记为半滑舌鳎性别控制和全雌育种提供了重要技术手段，在半滑舌鳎繁殖用亲鱼鉴定、雌核发育鱼苗鉴定、性别控制以及高雌苗种培育中具有重大应用价值和广阔的推广前景。

黄颡鱼雄性特异AFLP 标记的发现 黄颡鱼是我国重要淡水养殖鱼类。但黄颡鱼存在雌雄生长速率差异大，雌鱼生长速率明显慢于雄鱼，据报道，雄鱼要比雌鱼生长速率快2 倍。因此，开展黄颡鱼性别控制研究，培育全雄黄颡鱼苗种，对于黄颡鱼养殖产业发展具有重要意义和应用价值。中国科学院水生生物研究所桂建芳团队2009年使用256 个AFLP 引物组合对三种遗传性别的6 个样品(XX 混合样品、XX 个体、XY 混合样品、XY 个体、YY 混合样品和YY 个体)进行PCR 扩增后分析，发现共有24 个引物组合能够扩增出Y 或X 染色体连锁的片段。其中，引物组合E6M3 和E5M12 扩增出X 染色体连锁片段Pf63-X 和Pf512X；由此发现了黄颡鱼性染色体连锁的DNA 片段，筛选到黄颡鱼X 和Y 染色体连锁的AFLP 标记[14]，解决了黄颡鱼遗传性别鉴定的技术难题。

2.3 我国鱼类性别特异分子标记筛选的快速发展期(2013—2023)

我国鱼类性别特异分子标记筛选工作的爆发性增长 由于性别特异分子标记在鱼类性别决定机制研究和性控育种中的重要作用，长期以来，我国鱼类科研工作者一直努力在不同鱼类上筛选性别特异标记。然而，RFLP、RAPD、AFLP和SSR 等分子标记开发与鉴定通量低，工作量大，加之鱼类性别决定机制复杂，大多数鱼类具有性染色体分化不明显，性别特异区间小等特点，筛选到性别特异标记的鱼类种类较少。2014 年，中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林领衔完成了我国第一个养殖鱼类(半滑舌鳎)全基因组测序工作[15]，建立了通过雌、雄鱼基因组序列比对筛选性别特异分子标记的方法，大大提高了性别特异分子标记的筛选精度。随着全基因组测序在水产动物中的普及和测序成本的降低，高通量的基因组测序在鱼类性别特异标记的筛选中已经从参考工具发展为常用的技术手段，再加上通过传统分子标记技术筛选性别特异标记技术的发展和经验的积累，我国鱼类性别特异分子标记的研究进入快速发展期 (表1)，在包括半滑舌鳎、黄颡鱼、条石鲷、尼罗罗非鱼、鲤、大口鲇、大黄鱼、乌鳢、平鲉、大刺鳅、黄姑鱼、翘嘴红鲌、金钱鱼、鳙、鲢、奥利亚罗非鱼、斑石鲷、圆斑星鲽、鳗鲡、黄姑鱼、斑鳢、卵形鲳鲹、四棘金钱鱼、鲮鱼、香鱼、大口黑鲈、长吻鮠、弓背青鳉、光倒刺鲃等三十多种鱼类中筛选到性别特异分子标记。

鱼类性别特异分子标记的优化与鉴定应用 为了使性别特异分子标记更好进行产业化应用，在一些养殖鱼类中，性别特异分子标记及配套的遗传性别鉴定方法得到了优化。以半滑舌鳎为例，研究表明半滑舌鳎存在自然性逆转现象，在养殖群体中存在伪雄鱼，这种伪雄鱼遗传性别为ZW 雌性，生理性别为雄性，可产生精子并繁育后代。然而，其后代中伪雄比例占ZW 型鱼的90%以上，导致雌性比例大为降低。因此，在繁育前将雄性亲本进行遗传性别鉴定，剔除伪雄鱼，是培育半滑舌鳎高雌苗种的有效手段，而利用性别特异分子标记在养殖场对雄性亲鱼进行快速性别鉴定就显得尤为重要。然而，一般情况下养殖现场的实验条件恶劣，方法有限，鉴定速度和准确度难以保障。半滑舌鳎AFLP 雌性特异标记是显性标记，只能在ZW 雌鱼中扩增出一个条带，无法鉴别出由于DNA 提取质量差而导致的假阴性结果；而开发的半滑舌鳎微卫星性别特异标记，在Z 和W 染色体上扩增的片段只有12 bp的差异，适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分型，这在养殖场难以实现。针对这种情况，中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林团队从已开发的半滑舌鳎SSR 性别特异分子标记中选择Z 和W 染色体中扩增到的片段相差最大的一个(35 bp)重新设计引物，提高扩增片段中差异片段的占比，同时选用较高浓度的琼脂糖，提高小片段的分辨率，成功开发出了可用于琼脂糖分型的适用于养殖场现场鉴定的半滑舌鳎性别特异标记。以这一标记为核心工具，优化鉴定流程，在保证质量的同时缩短DNA提取时间，开发出了一套半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法，大大提高了养殖现场遗传性别鉴定的速度，并将鉴定结果准确率提高到100%[23]。此外，陈松林团队还结合半滑舌鳎性别相关基因的研究，开发出了差异片段为113 bp 的性别特异标记，进一步降低了适于鉴定的琼脂糖浓度，提高了鉴定效率[24]。在黄颡鱼中，围绕开发的雄性特异标记，也进行了性别鉴定流程的优化，提升了性别鉴定效率，为“全雄1 号”、“全雄2 号”新品种的研发提供了技术保证[52]。

3 鱼类分子标记辅助性控育种

目前，性别特异分子标记已经在部分鱼类性控育种中得到了应用，并取得了显著的成效。如在半滑舌鳎良种培育过程中，首先通过建立雄性候选亲本遗传性别现场快速鉴定技术，剔除伪雄鱼，保证了后代的高雌性比例在40%左右，随后对高雌苗种结合家系选育与基因组选择育种技术，培育出了抗哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染能力提高30.9%、18 月龄体重平均提高 17.7%、养殖成活率平均提高 15.7%的高雌速生抗病半滑舌鳎新品种“鳎优1 号”[53]。

由于黄颡鱼具有明显的性别二态性，在相同养殖条件下，第一年雄性黄颡鱼比雌鱼的生长速率快约30%，在养殖的第二年，雌雄生长差异接近3 倍。黄颡鱼通过人工诱导，可以得到XY 型生理雌鱼，进而繁育出YY 型超雄鱼，与XX 型雌鱼交配即可建立黄颡鱼全雄繁育体系。黄颡鱼雄性特异标记的研发，可以通过分子手段精准区分XY 型正常雄鱼和YY 型超雄鱼，大大降低筛选YY 型超雄鱼的工作量，解决了黄颡鱼“全雄1 号”、“全雄2 号”等全雄新品种技术难点。黄颡鱼 “全雄1 号”比普通黄颡鱼增产35%，而2023 年新通过审定的黄颡鱼“全雄2 号”在相同养殖条件下，12 月龄体重提高12.42%[54-56]。

尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼是罗非鱼属中的两个不同物种，分别为两种不同的性别决定类型，尼罗罗非鱼是XY 型，奥利亚罗非鱼是ZW 型。中国水产科学研究院珠江水产研究所使用分子标记辅助性控技术，以选育的尼罗罗非鱼通过性逆转及测交得到超雄个体(YYn♂)，再与选育的奥利亚罗非鱼雌性(ZW)杂交得到WY 型雌鱼，再与 YYn♂杂交获得超雄罗非鱼 YYa♂，得到的YYa♂作为父本，连续5 代选育的尼罗罗非鱼雌性作为母本，所得子代即为“粤闽1 号”新品种，其自然雄性率达到98.31%，在相同养殖条件下，“粤闽1 号”平均体重比同期养殖的吉富罗非鱼提高 23.77%，父本超雄罗非鱼制种相对简单，便于推广[57]。

截止到2023 年，我国审定的水产新品种共计283 个，其中鱼类新品种142 个，包括半滑舌鳎“鳎优1 号”、黄颡鱼“全雄1 号”、“全雄2 号”、虹鳟“全雌1 号”、罗非鱼“鹭雄 1 号”、“粤闽1 号”、“夏奥1 号”、杂交鳢“雄鳢1 号”、翘嘴鳜“鼎鳜 1 号”、翘嘴鲌“全雌 1 号”、黄姑鱼“全雌1 号”等11 个全雌/雄或高雌/雄水产新品种，性别特异分子标记在这些新品种培育中起到了重要的作用。

4 展望

4.1 持续开发养殖鱼类性别特异分子标记

我国养殖鱼类物种众多，具有巨大的开发潜力和推广前景。许多养殖鱼类存在性别差异现象，有必要进行性别控制和单性育种技术研究。性别特异标记是进行性控育种的重要基础工具，然而，我国养殖鱼类性别特异标记开发尚不充分，不能完全覆盖所有养殖鱼类的有关需求。近年来，在全基因组测序技术的辅助下，通过雌、雄个体的基因组重测序数据进行高通量比对，作为一种有效的技术手段，大大加快了养殖鱼类性别特异分子标记的开发进程。因此，整合建立我国养殖鱼类全基因组测序平台，集成基于基因组数据的鱼类性别特异标记筛选流程和技术体系，预期将对进一步提高鱼类性别特异分子标记的开发效率和普及程度起到推动作用。

4.2 强化鱼类性别特异分子标记筛选方法创新

在脊椎动物中，鱼类的进化地位较低，性别决定机制复杂，受到环境和遗传因素的共同影响。在基因组层面上，有些鱼类没有性染色体，有些鱼类的性别决定区域很小，这为鱼类性别特异标记的筛选带来了困难。现有的筛选方法，难以满足鱼类性别特异分子标记的研发需要，如大菱鲆目前还没有找到有效的性别特异分子标记。因此，针对鱼类基因组与性别决定机制的复杂现象，创新筛选方法，突破大菱鲆等鱼类的性别特异标记筛选难题，或将成为未来鱼类性别特异标记筛选的重要研究方向。

4.3 优化鱼类性别特异分子标记的应用方法

性控育种是提高养殖鱼类产量的重要方法，性别特异分子标记的研发为鱼类性控育种提供了有效工具。目前，虽然我国科研人员在三十多种养殖鱼类筛选到性别特异分子标记，然而已经应用于良种培育的性别特异标记还只有半滑舌鳎、黄颡鱼、罗非鱼、乌鳢、翘嘴鳜、黄姑鱼、虹鳟等少数鱼类，其他大多数养殖鱼类中采用性别特异标记培育良种的研究仍有待突破。

在实际的性控育种工作中，遗传性别的鉴定往往要在养殖场等简易实验条件下进行，高效的鉴定流程、简单的鉴定方法和可靠的鉴定结果是更好实现性控育种目标的必要条件。因此，在研发得到性别特异分子标记之后，围绕性别特异分子标记，结合高效核酸提取或分离技术，建立简洁有效的鉴定技术流程，将为养殖鱼类单性良种培育提供可靠的遗传性别鉴定技术手段。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）