星形孢菌素产生菌电转化条件的优化及其高产菌株的构建

黄浩龙　田勋　刘佳乐　张梦莹　胡海峰

摘要：目的 提高星形孢菌素的产量。方法 本研究以星形孢菌素产生菌（Streptomyces sp. ST-07）为出发菌株，采用电转化方法和应用PCR扩增星形孢菌素生物合成的调控基因staR，成功构建含不同启动子（kasO*p和ermE*p）的加强表达staR基因的重组工程菌，分别命名为ST-D-5和ST-H-23。结果 通过对电转化条件的甘氨酸浓度、电场强度、菌丝体浓度、质粒浓度、孵育时间和孵育温度等关键参数优化，使电转化的效率从4×106提高至9.6×108（CFU/?g DNA）；工程菌摇瓶发酵结果表明，与星孢菌素原始菌株ST-07相比，采用kasO*p 启动子构建的工程菌ST-D-5星形孢菌素的产量提高了17%，最高单位可达923 mg/L。结论 本文系统摸索了星形孢菌素产生菌的电转化条件，显著提高了电转化效率，不但为该菌株的高产遗传改造奠定了基础，而且对其他放线菌的遗传操作体系建立提供了有益借鉴。

关键词：星形孢菌素；电转化；staR基因；kasO*p；启动子；高产菌

中图分类号：R9文献标志码：A

Optimization of electrotransformation of staurosporine producing Streptomyces sp. and construction of high-yield mutants

Huang Haolong1，2， Tian Xun1，2， Liu Jiale1，2， Zhang Mengying1，2，  and Hu Haifeng1，2

（1 Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， China State Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai 200040;

2 Sinopharm Health Industry Institute Co.， Ltd.， Shanghai 201203）

Abstract Objective To improve the production of staurosporine. Methods In this study， Streptomyces sp. ST-07 was used as the starting strain， and its staR gene was amplified by electrotransformation and PCR. Engineered strains containing the staR gene overexpressed under the control of different promoters （kasO* pand ermE*p） were successfully constructed and named ST-D-5 and ST-H-23. Results The electrotransformation method was used to improve the efficiency of transformation from 4×106 to 9.6×108 （CFU/μg DNA） by optimizing key parameters such as the glycine concentration， the electric field intensity， the mycelia concentration， the plasmid concentration， incubation time and temperature. Shaking flask fermentation showed that the yield of staurosporine of engineered strain ST-D-5 with the kasO*p promoter was increased by 17%， and the highest titer reached 923 mg/L. Conclusion In this paper， the electrotransformation conditions of the bacteria producing staurosporine were explored systematically， and the electrotransformation efficiency was significantly improved. It not only laid a foundation for the genetic modification of high yield of this strain， but also provided a useful reference for the establishment of genetic manipulation system of other actinomyces.

Key words Staurosporine; Electrotransformation; StaR gene; kasO*p; Promoter; High-yield mutants

星形孢菌素（staurosporine，STA），最初發现于Streptomyces staurosporeus（AM-2282）菌株的发酵产物中，具有抗真菌、抗细菌、抗肿瘤和血小板凝聚等多种生物活性[1]，尤其对蛋白激酶C有强效抑制作用，可以诱导多类细胞的凋亡，具有广谱的抗肿瘤活性。但其选择性差、毒性大等特点，限制了其作为药物在临床方面的直接应用[3]。目前越来越多的星形孢菌素的衍生物被发现，主要有UCN-01和米哚妥林，米哚妥林是由星形孢菌素通过化学合成得到，于2017年美国FDA批准用于治疗急性髓性白血病。目前星形孢菌素主要通过微生物发酵的方式获得[1-2]，但是已报道的产生菌株的发酵单位较低，难以满足工业化生产的需求。

Onaka等[4]报道了菌株Streptomyces sp. TP-A0274合成星形孢菌素的生物过程，Salas等[5]在S. albus体内完整重建STA的合成路径通过双质粒系统方法。星形孢菌素的生物合成主要由吲哚咔唑环的合成和糖基的修饰二部分构成。

电转化是在电场脉冲的作用下使菌体的细胞壁上产生微孔通道，从而使外源DNA分子经该通道与裸露的细胞膜接触，进而进入到受体细胞内部，发生基因重组。使用电转化方法不仅可以避免胞外核酸酶对体内DNA的降解，还可以减少宿主对外源DNA的限制性修饰作用[6-7]。本研究尝试了电转化的方法并取得成功，但是转化效率不高。为了进一步提高转化效率，又对电转化条件进行优化，从而建立了一套高效的遗传操作体系，为研究该菌株的合成代谢途径、调控机理、遗传改良等方面奠定了基础。

根据相关文献报道，在星形孢菌素的生物合成基因簇中存在一个调控基因staR。staR基因属于LuxR家族转录调控基因[6，8]，LuxR家族蛋白是一种广泛存在于革兰阴性菌中的转录调控因子，可以特异性地与目的基因启动子的特定序列结合，从而增强或抑制目的基因的表达[9-10]。因此，本研究采用不同强度的启动子来构建staR基因的加强表达质粒，为提高星形孢菌素的产量做出有益探索[15]。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

MiniAmp PCR仪（赛默飞世尔科技）；Waters2998型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；EPS300型电泳仪（上海天能科技有限公司）；1652100型电转仪（美国Bio-rad公司）。

氨苄西林（Amp）、安普霉素（Apr）、卡那霉素（Kan）和氯霉素（Cm）（上海源聚生物科技有限公司）；DNA聚合酶、DNA连接酶、限制性内切酶（美国Thermo Scientific公司）；星形孢菌素标准品（上海Sigma-Aldrich有限公司，批号W2351A）；黄豆饼粉（青岛科瑞生物技术有限公司，批号200612）、玉米浆干粉（山东西王糖业有限公司，批号20220910）、酵母粉（安琪酵母股份有限公司，批号LP0021）、其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 菌株、质粒以及引物

本试验所涉及到的菌株见表1，涉及的质粒见表2，涉及的引物见表3。

1.3 培养基

LB 培养基（g/L）：酵母提取物 5，胰蛋白胨 10，氯化钠 10，pH 7.0。

ISP2培养基（g/L）：葡萄糖 4，酵母提取物 4，麦芽浸粉 10，琼脂粉 20，pH 7.0。

TSB培养基（g/L）：胰蛋白胨 15，大豆蛋白胨 5，氯化钠 5，pH （7.2±0.2）。

种子培养基（g/L）：玉米淀粉 4，玉米浆干粉 5，葡萄糖 15，大豆蛋白胨 5，碳酸钙 2，酵母粉 4，pH 7.0。

发酵摇瓶培养基（g/L）：葡萄糖 40，五水硫酸亚铁 0.5，黄豆饼粉 15，五水硫酸铜 0.5，酵母粉 5，玉米淀粉10，碳酸钙 4.0，七水硫酸镁 1.5，棉籽饼粉 17，磷酸二氢铵 0.5，pH 6.3。

2 方法

2.1 培养方法

平板培养：将甘油管保存菌株稀释1000倍，涂布于ISP2平板上，28℃培养6～7 d。

种子培养：从平板刮取1 cm×1 cm接种到30/250 mL种子培养基中，28℃、250 r/min培养2 d。

发酵培养：按10 %接种量将种子液转入30/250 mL摇瓶发酵培养基中，28℃、250 r/min培养7 d。

2.2 含量测定方法

取“2.1”项发酵培养7 d的培养物2 mL，加入95%乙醇2 mL，混匀，超声（250 W）30 min，取1 mL，12000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 ?m有机膜过滤后，HPLC测定星形孢菌素含量。

色谱条件：色谱柱Nova-Pak? C18-4 ?m （3.9 mm×150 mm）（Waters）；流动相A（乙腈）：流动相B（0.02 mol/L乙酸钠溶液）；流动相比例A： B=46： 54（V/V）等度洗脱；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长292 nm；进样量10 ?L。根据标准品的浓度计算发酵液中星形孢菌素的含量。

2.3 电转菌丝体的制备

取25 μL孢子悬液接种于25 mL/250 mL TSB 培养基中，28℃-220 r/min，摇床震荡培养 10～12 h；再将其以10 %的接种量转接于新鲜的TSB培养基中，摇床震荡培养8～10 h，A600在2.0～3.5之间。用50 mL无菌离心管分装菌液，4℃-6000 r/min，离心10 min，弃上清用相同体积提前预冷的去离子水重悬菌体沉淀，离心，重复1次。最后加入1 mL预冷的10%甘油溶液重悬菌丝体，以每管100 μL（菌丝体浓度约为1×109个/mL，（注：后續实验为了简化，菌丝体浓度统一用菌丝体体积来表述）分装至预冷的10 mL EP管中，液氮速冻，-80℃冷冻备用。

2.4 电转化步骤

将无菌电转杯放在冰上预冷10 min左右，取出-80℃保藏的ST-07电转感受态菌丝体，置于冰上融化，加入1 μL pSET152质粒（μg/μL），轻轻吹打均匀，冰上静置10 min。将ST-07电转感受态菌丝体及 pSET152 质粒的混合物转至预处理过的电转杯中，并用吸水纸将电转杯外壁的水吸干，再放入电转仪中进行电转（电转参数设置为：电压12 kV/cm，电阻200 Ω，电流25 μF）。电击完成后立刻加入800 μL TSB 培养液，吹打混匀后转移至1.5 mL EP 管中，28℃，220 r/min，摇床振荡培养2 h。将菌液涂布于 ISP2 平板培养基上（Apr终浓度：50 μg/mL），28℃倒置培养5～6 d。

3 结果

3.1 Streptomyces sp. ST-7电转化条件的优化

本实验以Streptomyces sp. ST-07菌株为遗传操作对象，探索该菌株的电转化体系，并对相关的电转化条件（甘氨酸浓度、电场强度、菌丝体浓度、质粒浓度、孵育时间及孵育温度）进行优化，从而建立了一套高效的遗传操作体系，电转化效率参照文献计算[7]。

3.1.1 安普霉素对ST-07的MIC

优化ST-07电转化体系条件的前提是对其安普霉素的MIC确定。在ISP2平板中加入不同浓度的安普霉素进行试验。表4结果显示，安普霉素对ST-07的MIC为30 ?g/mL，最终选择50 ?g/mL安普霉素作为转化子的筛选浓度。

3.1.2 ST-07生长曲线的确定

将ST-07的孢子悬液接种于TSB培养基中，每隔2 h取样测A600值。根据实验结果图1所示，在0～2 h时处于迟缓期，对数生长期为2～22 h，稳定期为22～38 h。其中ST-07在8～14 h的生长状态处于最佳时期，适合制备成菌丝体进行电转化实验。

3.1.3 甘油/甘露醇溶液的浓度比对电转化效率的影响

密度梯度离心常用的梯度介质为甘油、蔗糖和甘露醇等，结果表明（图2A）使用20%甘油/1.5%甘露醇溶液重悬星孢菌丝体，使其菌丝体处于一定浓度的渗透溶液中，维持菌丝体内外的渗透压平衡，增加菌丝体的存活率，使电转化效率的进一步提高。

3.1.4 不同质量浓度的细胞壁弱化剂对电转化的影响

在细胞壁合成过程中，甘氨酸作为细胞壁弱化剂可以替代细胞壁中肽聚糖层的D-丙氨酸，从而形成较松散的肽聚糖层，使得外源DNA更容易进入，但是当甘氨酸浓度过高时则会抑制菌丝生长。结果显示（图2B），甘氨酸浓度为2%时对电转化效率的改善效果最好。

3.1.5 不同电场强度对电转化的影响

电场强度和菌丝体大小共同决定了在菌丝体形成的电压降，这是电转化中电压的主要表现形式，电穿孔和细胞修复是相互制约的关系，因此，选择一个合适的电场强度对电转化效率提高有很大的影响。结果显示（图2C），电转化的电场强度为9 kV/cm，电转化效率较高。

3.1.6 不同ST-07浓度对电转化的影响

在电转化过程中，一定范围的ST-07菌丝体可以提高电转化的效率。因此，本研究选择不同浓度的ST-07进行电转化以获得最高的转化率。结果显示（图2D），当ST-07浓度为150 ?L时候，电转化效率较高。

3.1.7 不同质粒浓度对电转化的影响

在链霉菌的电转化试验中，质粒浓度越大，与感受态细胞碰撞的几率越大，能提高质粒进入“亲水孔”的概率。但质粒浓度超过一定范圍，反而会增大电转化过程中电转杯击穿的概率，降低电转化效率。结果表明（图2E），当质粒浓度为1 ?g时，电转化效率较高。

3.1.8 不同孵育时间对电转化的影响

在电转化的过程中，细胞容易受损，需要一定时间来自我修复损伤的膜结构，如果复苏时间不够长，也会导致转化效率的降低。结果表明（图2F），最佳的孵育时间为6 h，电转化效率为9.6×108（CFU/?g DNA）。

3.1.9 不同孵育温度对电转化的影响

在电转化过程中，低温条件对细胞壁与细胞膜的脆性有一定影响，在瞬时的高电压条件下在细胞表面更容易形成局部的瞬态孔隙，使得外源 DNA 更容易电转入细胞内部。结果表明（图2G），当温度为37℃时，其电转化效率仅为0.4×108 CFU/?g DNA，而当温度保持在0～4℃时，其电转化效率可达10.2×108 CFU/?g DNA，即0～4℃时的电转化效率比37℃时提高了约26倍。

3.1.10 优化前后电转化效率的对比

通过上述条件的优化，发现电转强度、孵育时间和孵育温度是影响电转效率的主要因素，并建立了适合该菌株的最优电转参数：甘油/甘露醇溶液的浓度为20%/1.5%，甘氨酸浓度为2%，电场强度为9 kV/cm，星孢菌丝体浓度为150 μL，质粒浓度为1 ?g，孵育时间为6 h及孵育温度为0～4℃。电转效率从4×106提高至9.6×108 （CFU/?gDNA）。本试验结果为后续的构建表达质粒提供了遗传操作基础。

3.2 工程菌的构建

3.2.1 质粒pSET152-staR-ermE*p和pSET152-staR-kasO*p的构建

以星形孢菌素产生菌ST-07的基因组为模板，用staR-F/R引物通过在体外通过PCR扩增得到，得到2.8 kb大小的staR基因片段。2个不同的启动子ermE*p和kasO*p，分别以pIJermE和pSBJ153为模板，以erm*E-F/R和kasO*P-F/R为引物通过PCR分别得到220和100 bp大小的片段。将获得的2种不同的启动子片段分别和staR基因片段与用NotINdeI酶切的pSET152质粒连接，获得pSET152-staR-ermE*p和pSET152-staR-kasO*p质粒（图3）。

3.2.2 ST-A-1、ST-D-5和ST-H-23工程菌的构建

按“2.1”中的平板培养对星孢产生菌ST-07进行培养，制备星孢菌丝体，将重组的质粒pSET152、pSET152-staR-kasO*p和pSET152-staR-ermE*p与DH5α感受态进行转化，抽提质粒，按照“3.1.10”优化好的电转化条件将重组质粒导入目标菌株ST-07中，从含有50 ?g/mL安普霉素的ISP2平板中分别挑取多个转化子进行摇瓶发酵，经HPLC检测效价，分别得到3种质粒的 ST-A-1、ST-D-5和ST-H-23高产工程菌。

3.2.3 工程菌的验证

将获得的ST-A-1、ST-D-5、ST-H-23菌株接种至含有50 ?g/mL安普霉素的ISP2平板，28℃培养5～7 d，均生长状况良好。将ST-A-1、ST-D-5、ST-H-23菌株进行PCR扩增验证（图4），PCR产物经DNA测序分析，确认为质粒pSET152、pSET152-staR-kasO*p和pSET152-staR-ermE*p。结果表明构建好不同启动子控制下的调控基因staR工程菌。

3.3 工程菌株发酵

按照“2.1”项下的方法进行发酵试验，使用ISP2平板培养基、种子培养基、初始发酵培养基，结果见图5。可见，ST-A-1菌株的星孢发酵单位与初始菌株ST-07相差无几，ST-D-5和ST-H-23菌株的星孢发酵单位与初始菌株ST-07分别提高17%和9%，其中ST-D-5星孢的最高单位可达923 mg/L，说明staR基因属于正调控基因，强启动子kasO*p效果更好，对该staR基因进行加强表达可以提高星形孢菌素的产量。

4 讨论

星形孢菌素主要通过微生物发酵获得，目前文献报道的星形孢菌素的产生菌株较多[11-13]，但是发酵单位较低，难以满足工业化生产的要求。传统的菌种选育方法很难解除微生物次级代谢产物生物合成过程中的限速步骤。通过基因工程的手段，可以定向并且理性的对菌株进行改造。本试验优化了电转化的条件，电转效率从4×106提高至9.6×108（CFU/?g DNA），为星形孢菌素产生菌的基因工程改造奠定了基础。在星孢产生菌电转入不同启动子的加强表达staR基因，获得工程菌ST-D-5、ST-H-23，其中ST-D-5菌株的星形孢菌素发酵单位比初始菌株ST-07提高了17%，最高单位可达923 mg/L。本试验通过构建不同启动子控制下的staR调控基因，提高了星形孢菌素的发酵单位，在后续研究中一方面可以考虑增加调控基因的拷贝数，筛选具有较高潜力的工程菌来进一步提高发酵单位。另一方面可以进一步优化发酵工艺，加强发酵过程中营养物质、菌体浓度、溶氧、pH等参数的检测和调节，可进一步提高星形孢菌素的产量，为其工业化生产奠定基础。

参 考 文 献

赵雪尔， 刘骏， 陈敏， 等. 星形孢菌素生物合成途径的研究进展[J]. 中国医药生物技术， 2011， 6（4）： 274-277.

徐岩， 路新华， 董悦生， 等. 星孢素研究进展[C]. 创新药物及新品种研究， 开发学术研讨会论文集， 2006： 280-283.

Kase H， Iwahashi K， Nakanishi S， et al. K-252 compounds， novel and potent inhibitors of protein kinase C and cyclic nucleotide-dependent protein kinases[J]. Biochem Bioph Res Co， 1987， 142（2）： 436-440.

Onaka H， Tanifguchi S I， Igarashi Y， et al. Cloning of the staurosporine biosynthetic gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0274 and its heterologous expression in Streptomyces lividans[J]. J Antibiot， 2002， 55（12）： 1063-1071.

Fabrizio P， Giuseppe L R， Monica B， et al. Violacinan， indole-derived purple-colored natural pigment produced by Janthinobacterium lividum， inhibits the growth of head and neck carcinoma cell lines both in vitro and in vivo[J]. Tumor Biol， 2016， 37（3）： 3705-3717.

He W， Lei J， Liu Y， et al. The LuxR family members GdmR I and GdmR ll are positive regulators of geldanamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus 17997[J]. Arch Microbiol， 2008， 189（5）： 501-510.

张正玉. 星形孢菌素产生菌的菌种改造及发酵工艺的优化[D]. 上海： 中国医药工业研究总院， 2020.

Li L， Wei K， Liu X， et al. aMSGE： Advanced multiplex site-specific genome engineering with orthogonal modular recombinases in Actinomycetes[J]. Metab Eng， 2019， 52： 153-167.

Huang H， Zheng G， Jiang W， et al. One-step high-efficiency CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Streptomyces[J]. Acta Bioch Bioph Sin， 2015， 47（4）： 231-243.

Schlenk R. F， Kaser S. Midostaurin： A multiple tyrosine kinases inhibitor in acute myeloid leukemia and systemic mastocytosis[J]. Small ， 2018， 8（1）： 199-214.

蒲小明， 林壁潤， 沈会芳， 等. 星形孢菌素产生菌H41-38的发酵工艺条件[J]. 微生物学通报， 2009， 36（11）： 1631-1637.

庄以彬， 王乂， 刘培培， 等. 复合诱变选育星形孢菌素产生菌[J]. 中国海洋药物， 2011， （2）： 276-279.

黄小龙， 黄东益， 周双清， 等. 海绵共生链霉菌及其发酵生产星形孢菌素的方法和应用.201711078476.7[P]. 2018-01-19.

王志娟， 黄鹤， 田勋， 等. 子囊霉素工程菌的构建及初步发酵工艺优化[J]. 中国抗生素杂志， 2021， 46（9）： 854-858.

Wang J， Wang W， Wang L， et al. A novel role of pseudo' gamma-butyrolactone receptors in controlling gamma-butyrolactone biosynthesis in Streptomyces[J]. Mol Microbiol， 2011， 82（1）： 236-250.

收稿日期：2022-09-27

作者简介：黄浩龙，男，生于1999年，在读硕士研究生，主要研究方向为微生物与生化药学，E-mail： huanghaolong@126.com

*通信作者，E-mail： haifenghu88@163.com