干细胞在泪膜为导向型干眼治疗中作用的研究进展△

顾华香 程 验 李鹏飞 张国伟 季 敏 管怀进

2017年,亚洲干眼协会在其新共识中明确指出干眼(DE)是一种多因素引起的以泪膜不稳定为核心特征的慢性疾病。泪膜由内侧的黏液层、中间的水液层和外侧的脂质层组成,炎症、泪液渗透压升高、睑板腺功能障碍、屈光手术、结膜松弛等均会导致泪膜的不稳定[1]。基于DE的新定义,该共识提出了泪膜导向型治疗的新概念,并强调了以泪膜作为治疗目标和稳定泪膜在DE治疗中的重要作用[2]。干细胞是具有自我更新和分化潜能的细胞,在一定条件下可以定向分化成机体内的功能细胞,具有很强的可塑性,目前发现的成体干细胞主要有造血干细胞、间充质干细胞、组织特异性祖细胞等[3]。来自眼部的干细胞以及其他来源如骨髓、脂肪的间充质干细胞因其强大的免疫调节功能、营养作用和分化能力已被尝试用于各种眼表疾病的治疗[4-6],可有效弥补药物治疗的不足,使病变的组织精准再生,维持眼表微环境的稳态。近年来,DE受到广泛关注,而泪膜导向型治疗的提出以及再生医学的新兴发展使得DE的治疗更倾向于精准化再生医疗模式。因此,本文将主要对干细胞在DE再生治疗中的作用机制进行综述。

1 泪膜动力学及生物学功能

与既往国际上提出的DE定义相比,此次亚洲干眼协会提出的新定义首次指出泪膜不稳定是引起眼部症状和视力损害的关键病理机制,眼表损伤不再作为DE确诊的必要条件,出现眼部不适症状结合泪膜不稳定即可确诊为DE[1]。

1.1 泪膜动力学及泪膜破裂

泪膜是眼表的重要组成部分,泪膜稳定是保护眼表上皮免受干燥应激的重要机制之一[7]。泪膜形成的过程大致分两步,首先,水液层随着眼睑瞬目涂布在眼表上皮表面,沉积时其厚度由上睑对泪液向上的抽吸力和眼表上皮对泪液向下的黏性阻力之间的平衡所决定[8];其次,睑板腺持续分泌脂质,再由下睑的脂质覆盖表面和缺乏脂质层的上泪液表面之间的张力梯度驱动而向上扩散形成脂质层[9]。随后黏蛋白沿着新形成的水—脂质界面扩散,进一步促进泪液和脂质在眼表的均匀分布[10]。因此,泪膜三层结构不应被看作独立的功能单位,而是相互协作的整体,其中任一成分的改变均会影响泪膜动力学改变,进而导致泪膜破裂[11]。研究表明,各类型的DE其泪膜破裂模式不同,如水液缺乏型DE表现为线条状或区域状泪膜破裂,脂质缺乏型DE表现为随机泪膜破裂,黏蛋白缺乏型DE表现为点状或酒窝状破裂,这均为眼科医生在临床诊疗中精准评估DE的分型及决定后续适用的治疗方案提供了新的诊疗思路[12]。

1.2 泪膜不稳定在DE发病机制中的作用

1.2.1 泪膜不稳定影响高阶像差

泪膜是光线接触到的第一个折射表面,在保持角膜表面光滑方面起着关键作用[13]。当系统出现波前像差时,折射光线不会再聚到预期的唯一像点,导致图像散焦或失真。研究表明,泪膜不稳定会增加患者不规则的高阶像差并引起眼球光学界面的异常,从而导致视觉功能和光学质量受损[14]。

1.2.2 泪膜不稳定对眼表的损害

在角膜上皮之前,泪膜是抵御环境和病原体的第一道细胞防线。泪膜不稳定会使眼表直接接触外界病原体,并导致机会性暴露,增加角膜上皮感染和损伤的机会[15]。同时,泪膜含有许多生长因子、抗菌肽、分泌型 IgA 和维生素等[16],它们通过维持免疫稳态并提高宿主防御能力对眼表健康至关重要[17]。一旦泪膜屏障破坏,先天性免疫反应和适应性免疫反应被激活将进一步引起眼表炎症,继而加剧上皮细胞的损伤。角膜上皮屏障的破坏是中重度DE的标志,常被用作评估DE严重程度的标准之一[18]。

1.2.3 泪膜不稳定引起角膜神经病理性疼痛

研究显示,眼表受到刺激会增加瞬目率,而滴用麻醉药会导致瞬目率降低[19]。由于眼表干燥或泪膜不稳定常会引起DE患者的眼表刺激,导致DE患者瞬目增加。当覆盖眼表的泪膜变薄时,浅表上皮细胞对频繁的瞬目运动产生的机械应力增高,从而会损伤终末神经分支,引起角膜慢性疼痛。这启动了神经退化和再生的循环,导致角膜和结膜神经纤维的结构发生改变[20]。再生后的神经兴奋性也会发生改变,接受刺激的阈值降低,导致DE患者出现痛觉过敏或异常性疼痛[21]。

2 干细胞在修复泪膜各层结构中的应用

2.1 水液层

水液缺乏型DE是DE的一个主要亚型,泪腺腺泡细胞产生和分泌初级泪液,构成泪膜中最主要的水液层,其分泌不足会严重影响眼表的稳态[18]。当泪腺受到急性或慢性损伤时,泪腺会被淋巴细胞和其他免疫细胞浸润,破坏腺泡、导管和肌上皮细胞的结构,导致泪腺功能的丧失,最终引起水液缺乏型DE[22]。Dietrich等[23]诱导缺水型小鼠模型后,通过移植骨髓来源的间充质干细胞使萎缩的腺泡细胞恢复到总泪腺组织的62.0%,与注射盐水后的自发再生相比,腺泡细胞增加了25.0%,并恢复了模型鼠的泪液总量。此研究证实了体外干细胞移植的高治疗潜力,并表明当内在再生潜力不足以恢复泪腺功能时,外用细胞疗法可实现更高的治疗效果。Gromova等[24]成功从小鼠泪腺中分选出表达细胞黏附分子的泪腺上皮祖细胞(EPCPs),分离出来的EPCPs在体外培育1周后可重新聚集分化为导管和腺泡结构;进一步研究证实,将EPCPs注射到血小板反应蛋白-1敲除(TSP-1-/-) 的DE小鼠泪腺中,这些 EPCPs可以成功地移植到病变导管和腺泡中并恢复腺泡结构,同时,EPCPs 可以增加患有慢性泪腺功能障碍的TSP-1-/-小鼠的泪液分泌。这证明了内源性祖细胞移植可用于治疗泪腺功能障碍所致的水液缺乏型DE。综上所述,与常规的人工泪液疗法相比,外源性干细胞或内源性祖细胞对治疗严重缺水型DE患者是一种更有希望的方法。

2.2 黏蛋白层

黏蛋白对泪膜的稳定性至关重要,其位于泪膜的最内层,多种黏蛋白嵌入角结膜上皮细胞的微绒毛之间,确保水液能均匀的涂布于眼表,结膜杯状细胞是分泌黏蛋白的主要来源[10]。然而患有严重眼表疾病者,如斯-约综合征、瘢痕型类天疱疮、移植物抗宿主病和累及结膜的严重碱烧伤,通常会存在结膜杯状细胞在眼表上皮细胞中完全丧失,引发黏蛋白缺乏型DE[25]。结膜上皮是由结膜上皮细胞和杯状细胞双类型细胞组成,其分化和发育尚未得到很好的表征,有研究一直在不断尝试各种策略来培养结膜上皮尤其是杯状细胞[26]。Nomi等[27]使用生长因子辅助培养策略,通过表皮生长因子首先驱动多能干细胞发育成为结膜上皮谱系,接着利用角质细胞生长因子诱导分离的细胞促进杯状细胞的成熟,成功培育出能产生黏蛋白的功能性结膜上皮细胞片。Zhong等[28]使用无饲养层培养系统成功地扩增了兔衍生的结膜干细胞,免疫荧光显示干细胞标志物和杯状细胞黏蛋白MUC5AC和MUC16呈阳性表达;接着将实验组细胞封装在水凝胶中,使用注射器将其输送到兔结膜囊下,通过使用慢病毒载体来标记细胞,结果显示,第5天水凝胶微结构成功将细胞递送到球结膜上皮中。这项研究成功地将3D打印技术与干细胞移植相结合,为干细胞将来能够治疗严重眼表疾病包括黏蛋白缺乏型DE的微创治疗提供了重要临床思路。除了干细胞移植工程,由干细胞脱细胞技术制成的脱细胞组织也被用于组织修复。一项结膜缺损的兔模型体内实验利用脂肪间充质干细胞的低免疫原性制造了脱细胞基质,与羊膜移植组相比,脱细胞基质组兔治疗后具有更好的分层上皮结构且含有更多的杯状细胞,且在促进伤口愈合方面显示出巨大的优势[29]。在眼表重建中,源于此类干细胞的脱细胞基质也可作为一种有前途的结膜组织替代物。随着对结膜杯状细胞表型的探索,利用细胞疗法或组织工程均有望在未来的临床治疗中使退化的杯状细胞结构再生并恢复其分泌功能,也为治疗黏蛋白缺乏型DE提供了新的视角。

2.3 脂质层

脂质层位于泪膜的最外侧,由睑板腺分泌并通过眼睑瞬目促使其释放,通过保护水液层不蒸发来维持眼表的稳态,同时还保护眼免受环境威胁和感染[30]。当睑板腺功能障碍影响睑脂生成时,可导致脂质缺乏型DE,且睑板腺功能障碍通常伴随着腺体萎缩缺失,这也是脂质缺乏型DE无法治愈的主要原因[31]。睑板腺由围绕中央导管组织的几个腺泡组成,腺泡包含分泌睑脂的睑板腺上皮细胞,在睑板腺细胞成熟并最终分化后,它们会破裂并释放其脂质成分[32]。因此,睑板腺细胞群在整个生命过程中需要不断更新补充,那么可能存在调节睑板腺细胞生长发育的成体干细胞群。一项动物体内实验显示,Krox20细胞系可诱导产生完整且成熟的睑板腺,若敲除Krox20则会导致睑板腺标志物K14和PPARγ的缺失,同时在眼睑中也检测不到油红O染色标记的脂质,这提示Krox20为睑板腺干细胞标志物,敲除Krox20可能会影响睑板腺的发育[33]。除干细胞标志物外,干细胞“生态位”的特征也尚未得到很好的表征,寻找睑板腺发育过程祖细胞起源的潜在位点也是一直在探索的方向。Parfitt等[34]通过使用H2B-GFP/K5tTA小鼠,在3D重建中利用谱系追踪转基因荧光标记发现,荧光标记细胞主要局限于腺泡内导管上皮的末端区域,这表明导管上皮的末端是睑板腺干细胞的潜在位点,而不是如先前阐明的那样位于外周或中央导管[35]。近年来的研究中,虽然睑板腺的形态发育得到了很好的描述[36],但睑板腺功能障碍介导DE的细胞动力学尚未完全清楚,能够成功鉴定出产生睑板腺的干细胞群对于恢复睑板腺的功能并再生腺体具有临床价值,这提示干细胞可作为脂质缺乏型DE的有效治疗策略。

3 结束语

2017亚洲干眼共识将泪膜不稳定定义为DE的核心特征,并在此基础上提出了泪膜导向型治疗策略, DE治疗需先确定哪一层泪膜受到影响,进而针对性治疗。鉴于DE的个体差异性和复杂性,仅仅是对症治疗仍停留在“治标”层面,仍有大量患者表现出久治难愈,因此,对常规治疗无效的个体亟待一种新型疗法。本文主要阐述了干细胞在各类DE中发挥的再生和替代作用。各层眼表组织中均存在干细胞的生态位,而且将各类型干细胞靶向移植治疗DE模型动物受损的外分泌腺取得显著效果。随着对干细胞分化潜能的深入研究和临床应用的不断探索,干细胞有望为更高效、更精准的DE治疗提供新的思路与方向。