多粘类芽胞杆菌JE53对香梨采后黑斑病菌抑制效果及贮藏品质的影响

郝金辉，林胜楠，吴梓菲，王 宁，詹发强，史应武，何亚芳，杨 蓉，侯新强，包慧芳*

（1.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052）

库尔勒香梨PyrussinkiangensisYü 是新疆优质特色品种，距今已有1400 多年栽培历史[1]，其具有皮薄肉脆、风味浓郁、汁多渣少、营养丰富等优良品质，在国内外市场上享有盛誉。库尔勒香梨属于典型的呼吸跃变型果实[2]，在采后贮藏过程中果实软化、品质下降，进而发生腐败变质，从而降低果实品质和商品价值，造成较大的经济损失。其中由互隔交链孢引起的黑斑病是其采后贮期的主要病害之一。因此，有效保持果实品质和减少病害发生是亟待解决的问题。

目前，香梨采后贮藏保鲜手段主要包括1-甲基环丙烯（1-MCP）[3]、低温[4]、气调保鲜[5]等。1-MCP处理可以延缓果实的衰老过程，延长贮藏期，相关研究表明，1-MCP 处理能够延缓果实色度角[6]、硬度[7]下降，抑制丙二醛含量上升，提高抗氧化酶的活性[8]，有效提高果实的贮藏期，延缓果实衰老，但对病原真菌的抑制效果不佳[9]。低温能抑制果实呼吸强度、保持良好感官品质、延缓衰老[10]，但长时间的低温冷藏容易使果实发生冷害而腐败。目前，生物保鲜尤其是微生物保鲜作为一种安全健康且性价比高应对果蔬采后保鲜问题的途径，成为国内外研究热点，也成为果蔬采后保鲜的重要发展方向。

微生物保鲜是指利用微生物菌体本身或其次级代谢产物来抑制或杀死果蔬中的有害微生物，从而达到防腐保鲜的效果。近年来，越来越多的研究报道表明，拮抗微生物可以抑制水果采后的生理代谢，保持果实的贮藏品质[11]。此外，研究还发现，拮抗微生物能够通过调节水果抗氧化系统，减少自由基的产生，从而保持水果品质[12]。

多粘类芽胞杆菌JE53 为本研究团队在前期研究中筛选获得，对梨黑斑病菌互隔交链孢具有显著抑制效果，前期研究结果表明，JE53 可分泌纤维素酶、蛋白酶、葡聚糖酶，可抑制梨黑斑病菌孢子萌发，还可造成菌丝畸形、表面粗糙、扭曲凹陷[13]。本论文在此基础上测定了JE53 发酵液对库尔勒香梨采后黑斑病菌抑制效果及贮藏品质的影响，以期为香梨采后黑斑病的生物防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试库尔勒香梨，选择无病害、无伤口、成熟度和大小、色泽一致的市售果实作为实验材料。

香梨黑斑病菌互隔交链孢、多粘类芽胞杆菌P.polymyxa（JE53）由本实验室前期分离鉴定和保存。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗菌JE53 对链格孢抑制效果测定 将香梨果实用0.2% NaClO 浸泡2 min 进行表面消毒后，再用无菌水冲洗，自然晾干。果实分为3 组进行以下处理，每处理9 个梨：（1）无菌水浸泡3 min 作为对照1；（2）1-MCP 处理24 h 作为对照2：参考李学文等的方法[14]，室温下，将香梨果实放置在由PE 膜（0.1 mm 厚）制成的密封的1 m3帐中，精确称取1.6 g 1-MCP 药剂（0.014%，SmartFresh 粉剂）放入50 mL 烧杯中，放置于塑料帐中, 加入10 mL 蒸馏水，轻摇，迅速密封PE 帐，使其中1-MCP 浓度为1.0 μL/L，熏蒸24 h 后，揭开PE 帐，通风30 min；（3）拮抗菌JE53 发酵稀释液（约2×108cfu/mL）浸泡3 min作为处理组。

在上述处理后的香梨果实上打3 个孔（直径7 mm，深5 mm），分别添加10 μL 病原菌孢子悬浮液（约2×105孢子/mL）。置于人工气侯箱（温度25 ℃、RH 95%）贮藏，观察果实发病状况，144 h 统计果实发病后病斑直径并根据如下公式计算抑菌率。抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。

1.2.2 拮抗菌JE53 对果实贮藏品质及生理特性指标测定 果实分为3 组进行以下处理，每处理9 个梨：（1）无菌水处理，即将香梨用无菌水浸泡3 min；（2）1-MCP 处理，即参照李学文等的方法[14]，室温下，将香梨果实放入塑料周转箱中，放置在由PE 膜（0.1 mm 厚）制成的密封的1 m3帐中，精确称取1.6 g 1-MCP药剂（0.014%，SmartFresh 粉剂）放入50 mL 烧杯中, 放置于塑料帐中，加入10 mL 蒸馏水，轻摇，迅速密封PE 帐，使其中1-MCP 浓度为1.0 μL/L，熏蒸24 h 后，揭开PE 帐，通风30 min；（3）拮抗菌JE53处理，即将香梨用拮抗菌JE53 稀释液（约2×108cfu/mL）浸泡3 min。处理完毕将果实置于人工气侯箱（温度 25 ℃、RH 95%）贮藏15 d，每3 d 进行取样，每个处理随机取3 个香梨，测定以下品质及生理特性指标，重复3 次。

a）色度角（H°）测定 采用高品质电脑色差仪（NR10QC）沿果实赤道取3 点测定[15]，取平均值。记录L*值、a*值和b*值，L*表示亮度；a*值代表红绿色调，正值为红色；b*代表黄蓝色调，正值为黄色。按以下公式计算色度角H°来表示色泽的变化[16]：H°=180°+arctan（b* /a*）。

b）失重率测定 记录梨果在贮藏前和贮藏期间的重量，计算失重率（%）。计算公式如下：

c）果实内在品质指标测定 每个处理随机选取3 个样本，用水果硬度计（浙江托普云农科技股份有限公司，GY-4）在果实赤道区域等距离3 点进行测定硬度值，结果取平均值，单位Kg[17]。可溶性固形物（TSS）含量采用TD-45 数显糖度计测定[18]，单位%；可滴定酸（TA）含量采用酸碱中和滴定法[19]，结果以苹果酸折算系数0.067 计算，单位%；抗坏血酸（AsA）含量采用抗坏血酸（AsA）含量测试盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定，单位μg/g。

d）丙二醛（MDA）含量测定 采用丙二醛（MDA）含量测试盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定，单位nmol/g。

e）防御酶活性测定（PPO、POD、PAL、CAT）采用试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定。

1.3 数据统计与分析

所有结果均运用SPSS 软件对数据进行处理分析，经Duncan’s 新复极差法检验组间差异，P＜0.05 表示差异显著；所有数据为平均值±标准误。使用Origin 2021 进行数据整理并绘图。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌对梨黑斑病菌体内抑制效果

在观察记录过程中发现，1-MCP 处理不能有效抑制病原菌的生长，96 h 前病斑直径显著大于对照CK组病斑直径，120 h 后病斑直径与对照CK 组病斑直径差异不显著。贮藏至144 h，如图1 所示，对照组（CK组和1-MCP 组）梨果实病原菌菌丝生长旺盛，而经JE53 处理后病原菌生长受到明显抑制，且病斑直径显著小于对照组病斑直径。由图2B 可知，拮抗菌JE53 对梨黑斑病抑制效果优于1-MCP，贮藏144 h 时抑菌率为30.73%。

图1 144 h 时各处理对梨黑斑病菌的防治效果Fig.1 The inhibition effect of each treatment on pear black spot pathogen in 144 h

图2 96-168 h 内各处理菌丝生长情况Fig.2 The growth of hyphae within 96-168 h

2.2 拮抗菌对梨果实采后贮藏品质的影响

2.2.1 菌株JE53 对梨果实色度角的影响 由图3A 和图3B 可知，在贮藏过程中，三组梨果实的亮度L*值和色度角H°均呈现下降趋势，总体来说，CK 组下降速率最快、JE53 次之，1-MCP 下降速率最慢。图3A 表明，在第15 d 时，CK 组L*值（56.34）显著低于JE53 处理组 （61.60，P＜0.05）。图3B 表明，JE53处理组H°低于1-MCP 组，但显著高于CK 组（P＜0.05）。由上可知，JE53 处理能延缓贮期梨果实亮度及色度角的下降，延缓果皮由绿转黄，其保绿性能不及1-MCP，但显著优于自然贮藏效果。

图3 JE53 处理对香梨贮藏期间色度的影响Fig.3 Effect of strain JE53 on chromaticity of pear fruit during storage

2.2.2 菌株JE53 对梨果实失重率的影响 由图4 可知，在贮藏过程中各处理果实的失重率均呈现上升趋势；但JE53 处理组与1-MCP 组失重率上升速率均低于CK 组，JE53 处理组与1-MCP 组间差异不显著（P＞0.05）。第15 d，JE53 处理组失重率（1.47%）低于对照组失重率（1.82%），且差异显著（P＜0.05）。结果表明，拮抗菌JE53 能有效维持果实水分，减少贮藏期间质量损失，从而延长贮藏期。

图4 JE53 对香梨贮藏期间失重率的影响Fig.4 Effects of strain JE53 on weight loss rate of pear fruit during storage

2.2.3 菌株JE53 对梨果实硬度的影响 由图5 可知，各处理梨果实硬度均随着贮藏期的延长逐渐下降，但JE53 处理组下降速率显著低于CK 组。第15 d 时，JE53 处理组梨果实硬度为3.78 Kg，分别为CK 组（2.51 Kg）和1-MCP 组（3.09 Kg）的1.51 倍和1.22 倍，且差异显著（P＜0.05）。结果表明，拮抗菌JE53 处理能更好维持果实较高的硬度。

图5 JE53 对香梨贮藏期间果实硬度的影响Fig.5 Effect of strain JE53 on the firmness of pear fruit during storage

2.2.4 菌株JE53 对梨果实TSS 含量的影响 如图6 所示，随着贮藏期延长，梨果实TSS 含量整体呈先上升后下降趋势。在贮藏初期各处理TSS 含量有所上升，这可能与果实中含有淀粉等大分子物质，并在成熟过程中不断向糖的转化有关[26]。随着贮藏期延长，各处理TSS 含量均呈下降趋势，这可能与TSS 作为呼吸底物被代谢降解有关[27]。CK 组TSS 含量于第6 d 时上升至最大值，随后迅速下降；1-MCP 组TSS 含量于9 d 时上升至最大值，随后逐渐下降；而JE53 处理组TSS 含量缓慢上升，第12 d 时达到最大值（11.5%），随后平缓下降。第15 d 时，JE53 处理组TSS 含量（11.43%）为CK 组（10.1%）1.13 倍，差异显著（P＜0.05）。结果表明，拮抗菌JE53 处理能有效减缓梨果实TSS 含量的下降。

图6 JE53 处理对香梨贮藏期间TSS 含量的影响Fig.6 Effect of strain JE53 on TSS content of pear fruit during storage

2.2.5 菌株JE53 对梨果实TA 含量的影响 由图7 所示，随着贮藏期延长，梨果实TA 含量整体呈下降趋势。与CK 组相比，JE53 处理组TA 含量下降速率平缓，1-MCP 组次之。第15 d 时，JE53 处理组的TA含量为0.067%，显著高于CK 组的0.053%（P＜0.05）。结果表明，JE53 处理能有效减缓贮期梨果实TA含量的下降。

图7 JE53 处理对香梨贮藏期间可滴定酸的影响Fig.7 Effect of strain JE53 on TA of pear fruit during storage

2.2.6 菌株JE53 对梨果实MDA 含量的影响 如图8 所示，随着贮藏时间的延长，香梨果实MDA 含量逐渐上升。CK 组上升速率最快，JE53 处理组上升速度最为平缓，1-MCP 组次之。贮藏末期，JE53 处理组MDA 含量（11.53 nmol/g）低于CK 组（14.68 nmol/g），且差异显著（P＜0.05）。结果表明，JE53 处理可显著降低梨果实MDA 含量的积累，抑制膜脂过氧化，提高梨果实的贮藏保鲜期。

图8 JE53 处理对香梨贮藏期间丙二醛的影响Fig.8 Effect of strain JE53 on MDA of pear fruit during storage

2.2.7 菌株JE53 对梨果实AsA 含量的影响 由图9 可知，在贮藏期间各处理组梨果实AsA 含量呈下降趋势，但JE53 处理组梨果实AsA 含量始终高于CK 组。第15 d 时，JE53 处理组梨果AsA 含量（209.23 μg/g）为CK 组含量（164.86 μg/g）的1.27 倍，且差异显著（P＜0.05）。这与MDA 测定结果相对应，JE53 处理降低果实中MDA 的积累，因此消耗了更少的AsA，而CK 组果实脂质过氧化较为严重，导致损耗更多的AsA。结果表明，JE53 处理可显著降低梨果AsA 含量的下降。

图9 JE53 处理对香梨贮藏期间抗坏血酸的影响Fig.9 Effect of strain JE53 on AsA of pear fruit during storage

2.3 拮抗菌对香梨果实生理特性的影响

2.3.1 菌株JE53 对梨果实PPO 活性的影响 由图10 可知，在贮藏过程中，处理组与对照组PPO 活性的变化趋势基本一致，总体呈现先上升后下降的趋势。第0～6 d，各处理梨果实PPO 活性均缓慢升高，1-MCP组PPO 活性高于JE53 处理组和CK 组，但差异不显著（P＞0.05）。第6～15 d，各处理梨果实 PPO 活性均呈下降趋势，JE53 处理组与对照组组间差异不显著（P＞0.05）。结果表明，JE53 处理对梨果实贮期PPO活性无显著影响。

图10 JE53 处理对香梨PPO 活性的影响Fig.10 Effect of strain JE53 on PPO of pear fruit during storage

2.3.2 菌株JE53 对梨果实POD 活性的影响 由图11 可知，在贮藏期间，JE53 处理组梨果实POD 活性始终显著高于对照组（CK 组和1-MCP 组）；第0～6 d，JE53 处理组POD 活性逐渐上升，第6 d 时POD 活性达375.87 U/g，随后逐渐下降。贮藏末期，JE53 处理组梨果实POD 活性为273.87 U/g，为1-MCP 组（190.57 U/g）的1.44 倍，为CK 组（98.37 U/g）的2.78 倍。由此可见，JE53 处理能够诱导果实更高的POD 活性，并减缓其下降速度，从而提高果实抗氧化能力。

图11 JE53 处理对香梨POD 活性的影响Fig.11 Effect of strain JE53 on POD of pear fruit during storage

2.3.3 拮抗菌对香梨CAT 活性的影响 如图12 所示，在贮藏过程中，各处理梨果实CAT 活性随贮藏时间呈先升高后下降的趋势，但JE53 处理组CAT 活性始终高于对照组（CK 组和1-MCP 组）。第15 d 时，JE53 处理组CAT 活性（62.87 nmol/min/g）较CK 组（43.08 nmol/min/g）高31.48%，且差异显著（P＜0.05）。由此可见，JE53 处理能够诱导果实产生更高的CAT 活性，以减缓果实发生氧化损伤。

图12 JE53 处理对香梨CAT 活性的影响Fig.12 Effect of strain JE53 on CAT of pear fruit during storage

2.3.4 拮抗菌对香梨PAL 活性的影响 由图13 可知，CK 组梨果实PAL 活性在0～3 d 逐渐上升，第3 d达到峰值（10.68 U/g）后开始下降；1-MCP 组PAL 活性在第6 d 达到最大值（12.26 U/g）后逐渐下降；而JE53 处理组梨果实PAL 活性在0～9 d 均呈现上升趋势，第9 d 达到峰值（18.06 U/g）。第15 d 时，JE53处理组梨果实PAL 活性为11.87 U/g，为CK 组（6.55 U/g）的1.81 倍，为1-MCP 组（8.85 U/g）的1.34倍，且差异显著（P＜0.05）。结果表明，JE53 处理有利于提高贮期梨果实PAL 活性。

图13 JE53 处理对香梨PAL 活性的影响Fig.13 Effect of strain JE53 on PAL of pear fruit during storage

3 讨论

香梨在采后贮藏期间易受病原菌侵染，导致果实腐败变质，造成巨大经济损失；其中由互隔交链孢引起的黑斑病是其采后贮期的主要病害之一。目前香梨的采后防腐以化学手段为主，但其具有高残留、污染环境等缺点；因此，微生物防腐正以其安全、环境友好等优点逐渐成为果蔬采后防腐的研究热点。本研究前期对库尔勒香梨采后黑斑病进行了拮抗菌筛选，通过平板对峙法获得了一株对梨黑斑病菌具有显著拮抗效果的菌株JE53，该菌可分泌纤维素酶、蛋白酶、葡聚糖酶，抑制梨黑斑病菌孢子萌发，还可造成菌丝畸形、表面粗糙、扭曲凹陷。本研究采用1-MCP 熏蒸处理作为试验阳性对照，采用损伤接种病原菌方法评估拮抗菌JE53 对贮期梨果实的防腐效果。结果表明，拮抗菌JE53 可明显抑制梨果实上病原菌菌丝生长。处理144 小时后，抑菌率只有30.73%，推测其可能是因为采取了损伤接种，破坏程度较高，同时人为接种病原菌浓度较高。在自然贮藏条件下，病原菌浓度相对较低，其抑菌效率应可提升。

果实采后开始进入成熟和衰老阶段，这一过程涉及一系列复杂的生理生化反应。拮抗菌处理后果实的品质也是评价拮抗菌应用前景的指标之一[20,21]。本研究发现，经JE53 发酵液浸泡处理后，梨果实贮藏期间主要品质指标（色度、失重率、硬度、TSS、TA、AsA、MDA）均优于CK 组，说明拮抗菌JE53 能够较好保持果实采后贮藏品质，这一结果与季小诗等[22]研究结果一致，他们报告了膜醭毕赤酵母GS-316 发酵液处理能够降低冬枣失重率升高速率、抑制可滴定酸含量和VC 含量的下降。推测拮抗菌可能在梨果实表面形成一层保护膜，以减少果实水分及营养的损耗，从而延长贮藏期。

另外，大量研究表明，抗氧化防御系统对果实采后贮藏过程中的软化、变质、衰老、腐败等起到至关重要的作用[23]。其中，抗氧化能力不足是导致果实品质劣变的关键因素。果蔬中的抗氧化酶主要包括POD、CAT 等，它们参与清除果实中过量的过氧化氢、ROS 和自由基，减轻果实的氧化损伤和衰老[24]。PAL 是与抗病相关的酶，在植物的正常生长发育和抵御病原体入侵方面发挥着重要作用[25]。越来越多的研究表明，贮藏期间果肉实品质与果实后熟过程中酶活力的变化密切相关，抗氧化能力能力的提高有助于维持香梨、枣果[8]、杏子等果实品质、延缓衰老并延长保质期[26]。Cheng 等[8]研究发现，枣果的可溶性固形物、硬度的保持可能与1-MCP 和壳聚糖的联合处理对POD、SOD、CAT、APX 等抗氧化防御酶活性的提高及PPO 和LOX 的活性的抑制有关。如研究发现，贝莱斯万芽孢杆菌B.velezensisBG-2 处理可以延缓甜瓜失重率上升，抑制果实硬度和果皮色度的下降，减少TSS、TA 和AsA 的损耗，这可能与甜瓜果实内POD、PAL 等防御相关酶活性的提高相关[27]。本研究中，拮抗菌发酵液处理对PPO 活性无显著影响，但可显著提高梨果实中POD、CAT 和PAL 活性。由此推论，拮抗菌JE53 对梨果实的防腐作用可能与此类抗氧化防御酶活性的提高有关。

本研究表明，拮抗菌JE53 发酵液能有效控制梨黑斑病菌在梨果实上的生长，能够降低果实失重率，延缓果皮色度及硬度的下降，减缓TSS 和TA 含量的下降，减少MDA 含量的积累及AsA 的损耗，维持香梨果实贮藏品质；此外，JE53 能够提高梨果实抗氧化酶POD、CAT、PAL 活性，更有利于果实的贮藏保鲜。综上所述，菌株JE53 对香梨具有良好的保鲜效果，可以作为香梨采后防腐保鲜的菌种资源。