mTOR 蛋白对老龄大鼠肌腱干细胞修复能力影响△

谷成毅，陈明亮，丁松，周游

（三峡大学附属仁和医院骨科，湖北宜昌 443001）

雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一类大分子蛋白质，分子量为289 kDa，作为细胞多种病理生理过程的关键调控分子，在不同的组织细胞中均有表达，在细胞病理生理过程中的作用至关重要［1］。mTOR 存在两种不同复合物形式，即mTORC1 和mTORC2［2］。mTOR 整合细胞外多种信号刺激，参与体内多条信号通路，影响转录及蛋白质合成，与细胞凋亡、自噬、生长等均有重要联系［3］。mTORC 1 在干细胞自我更新和分化方面也起到很重要的作用［4］。

肌腱干细胞（tendon stem cell,TSC）是一群存在于肌腱中具有多向分化能力的间充质干细胞，在合适的条件下可以分化为肌腱组织、骨骼组织或者软骨组织［5］。有研究发现肌腱干细胞在肌腱病的发生、发展中也扮演着重要角色［6，7］。当肌腱干细胞处于异常的诱导环境时，会朝着非肌腱细胞方向分化［8］。老龄化会使肌腱干细胞的干性降低，增殖能力、克隆能力都显著下降，从而更易于向非肌腱细胞方向分化［9］。肌腱中残存的干细胞对于组织的再生、修复非常重要，然而老龄化会导致肌腱中肌腱干细胞数目下降而且功能减弱［10］。有临床研究表明，老龄化肌腱的愈合能力很差，严重影响老龄人群肌腱病的术后康复效果［11］。

mTOR 参与干细胞的更新分化，故本研究拟通过调控mTOR 蛋白观察其对老年大鼠肌腱干细胞成肌腱分化的影响，从而找出针对老年肌腱损伤、疾病修复的新思路，为临床提供帮助。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，老年大鼠（1年，28 只）和青年大鼠（12 周，4 只），清洁级，由陆军军医大学实验动物中心提供。体外实验分为老年大鼠（4 只）和青年大鼠（4 只）两组；体内实验分为mTOR 表达（6 只）、mTOR 干扰（6 只）、GFP（6只）、空白（6 只）。

1.2 体外试验

1.2.1 TSCs 的分离培养

老年和青年SD 大鼠各4 只CO2安乐处死，取跟腱剪碎，0.25%胰酶消化1 h。4℃1 000 r/min 离心，加10%胎牛血清DMEM 培养液（1×10/ml）。接种于25 cm2培养瓶中，37℃、5% CO2培养。2 d 后换液，2～3 d 换液1 次，细胞占瓶底80%左右时进行传代。传至3 代，进行后续实验。

1.2.2 老年大鼠TSCs 转染

将老年大鼠TSCs 分为mTOR 表达、mTOR 干扰、GFP 和空白四组。使用腺病毒转染制作mTOR表达、mTOR 干扰和GFP 的TSCs。取第3 代老年大鼠TSCs，通过重组腺病毒Ad-mTOR 按照预实验测定的最大MOI 值（100）转染，12 h 后换完全培养基，培养48 h，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。

1.2.3 Western blot 检测

各组细胞加入RIPA 裂解液置于冰上30 min。然后12 000 r/min 离心15 min，收集上清液，检测总蛋白浓度。4%～20%梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，室温5%的脱脂牛奶封闭1 h。加入一抗mTOR（1∶1 000）、Raptor（1∶500）、S6K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）摇晃过夜。TBST 清洗3 遍，加二抗（1∶10 000）避光摇晃1 h，洗涤3 次。BIO-RAD 凝胶电泳图像分析仪采图，图像分析软件统计分析，检测各指标的表达强度。

1.2.4 肌腱修复材料制备

（1）3 瓶上述SD 老龄大鼠TSCs，腺病毒处理分为mTOR 过表达、mTOR 干扰、GFP。转染72 h 后收细胞备用；（2）称2.2 g 脱乙酰度＞95%的壳聚糖溶100 ml 的0.1 mol/L 的冰醋酸溶液中，配成2.15 wt%壳聚糖C 溶液。磁力搅拌器保持50℃左右搅拌4 h，121℃消毒10 min。称5 g β-甘油磷酸钠溶于5 ml 去离子水中，搅拌均匀得到50 wt% GP 溶液，用0.22 μm 的滤器过滤除菌。取6 ml C 溶液，再将1 ml 的GP 溶液逐滴加入到C 溶液中，混合均匀获得C/GP溶液；（3）将水凝胶和目的细胞悬液按照2∶1 的体积比配置备用。

1.3 体内试验

1.3.1 髌腱损伤与修复

将24 只老年大鼠分为mTOR 表达、mTOR 干扰、GFP 和空白四组，每组6 只。异氟醚麻醉，取仰卧位，酒精消毒双侧膝关节。以右侧膝关节为例，膝屈曲30°，取正中切口，全长2 cm 至髌骨上下缘，切开皮肤、筋膜显露髌腱，使用2 mm×5 mm 的模版去掉髌腱组织，得到损伤模型。在髌腱缺损处加入50 μl 的水凝胶和实验细胞混合液，关闭切口，同法处理对侧。待术后2 周和4 周，每组每次3 只取髌腱进行检测。

1.3.2 HE 染色

制作SD 老龄大鼠髌腱损伤修复模型，分别在2周、4 周收取髌腱标本经处理成石蜡切片，将组织用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，后切片机冠状面连续切片（5 μm），脱蜡后HE 染色。每组随机取5张切片置于IX70 显微镜下观察3 个视野中髌腱缺损的修复情况。组织学评分标准：从纤维结构、纤维排列、核圆程度、炎症细胞、静脉数量和细胞数量等方面进行评分。

1.3.3 免疫组化

先石蜡组织脱蜡后水化，再用胰酶修复法修复，使用SCX、Col1 的1 抗抗体溶液。染色液镜下染色苏木素染核，90s 后60℃水浴环境下返蓝10 min。梯度乙醇脱水，常温下晾干，中心树胶封片。使用光密度（optical density,OD）计量。

1.3.4 生物力学测试

采用CO2安乐处死模型大鼠。取2、4 周大鼠髌腱缺损模型的完整后肢，保留髌骨和胫骨髌腱，使用生物力学测试仪进行生物力学检测，测量修复组织的最大损毁强度（单位N）。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0 统计软件对数据进行分析，计量数据以±s表示，资料呈正态分布时，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；资料呈非正态分布时，采用秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 青年与老年大鼠TSCs 的mTOR 相关蛋白表达比较

青年与老年大鼠肌腱干细胞中mTOR 及相关蛋白的表达Western blot 见表1 所示：mTOR、Raptor、P-Raptor 表达老年组显著高于青年组（P＜0.05）；而AKT、P-Akt、S6K、P-S6k 两组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 青年与老年大鼠TSCs 的mTOR 相关蛋白相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs between young and old rats( ±s)

表1 青年与老年大鼠TSCs 的mTOR 相关蛋白相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs between young and old rats( ±s)

指标mTOR Raptor P-Raptor Akt P-Akt S6k P-S6k青年组（n=3）0.9±0.1 2.2±0.3 0.7±0.0 2.3±0.1 0.8±0.0 6.2±0.6 4.7±0.4老年组（n=3）1.8±0.1 4.1±0.3 2.1±0.1 2.3±0.0 0.8±0.1 6.2±0.6 4.6±0.4 P 值0.032 0.028 0.012 0.083 0.102 0.096 0.094

2.2 老年大鼠TSCs 体外转染后mTOR 相关蛋白表达比较

老年大鼠TSCs 体外转染后mTOR 及相关蛋白的表达Western blot 见表2。mTOR、Raptor 及P-Raptor表达从高到低的顺序：mTOR 的表达组＞GFP 组＞mTOR 干扰组（P＜0.05）；而AKT、P-Akt、S6K 和P-S6k 的表达三组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 老年大鼠TSCs 体外转染后mTOR 相关蛋白表达比较( ±s)Table 2 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs transinfected differently in the old rats( ±s)

表2 老年大鼠TSCs 体外转染后mTOR 相关蛋白表达比较( ±s)Table 2 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs transinfected differently in the old rats( ±s)

指标P 值mTOR Raptor P-Raptor Akt P-Akt S6k P-S6k mTOR 表达组（n=3）3.9±0.1 1.0±0.0 4.2±0.6 1.2±0.1 3.4±0.5 4.1±0.7 3.7±0.4 mTOR 干扰组（n=3）1.2±0.0 0.3±0.0 1.5±0.2 1.2±0.0 3.1±0.4 3.9±0.6 3.3±0.4 GFP 组（n=3）2.1±0.1 0.6±0.1 2.1±0.2 1.2±0.1 3.6±0.6 4.1±0.6 3.6±0.4 0.015 0.021 0.032 0.076 0.082 0.091 0.094

2.3 体内修复检测结果

HE 染色观察髌腱损伤的修复效果见图1、表3，与术后2 周相比，术后4 周四组HE 组织评分均显著增加（P＜0.05），相应时间点分数从高到低的顺序依次为mTOR 干扰组＞GFP 组＞mTOR 表达组＞空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。组织学评分mTOR 干扰组相对其他三组纤维排列相对更整齐，炎症细胞数量更少，静脉数量和细胞数量明显增多。

表3 老年大鼠髌腱修复检测结果比较（±s）Table 3 Comparison of assay consequences after patellar tendon repair in the old rats( ±s)

表3 老年大鼠髌腱修复检测结果比较（±s）Table 3 Comparison of assay consequences after patellar tendon repair in the old rats( ±s)

指标HE 组织评分时间点2 周4 周P 值2 周4 周P 值2 周4 周P 值2 周4 周P 值P 值0.016 0.021 Col1 组化(OD)0.006 0.005 SCX 组化(OD)0.008 0.009最大损毁强度(N)0.038 0.041空白对照组（n=6）2.3±0.1 3.3±0.7 0.042 1.1±0.1 1.1±0.1 0.085 0.9±0.1 1.0±0.1 0.083 15.0±0.1 24.1±0.1 0.044 mTOR 表达组（n=6）5.1±0.8 7.2±1.0 0.047 0.4±0.1 0.4±0.1 0.079 0.4±0.1 0.4±0.1 0.069 17.1±0.2 26.1±0.3 0.041 mTOR 干扰组（n=6）13.2±1.2 17.5±1.4 0.038 4.3±0.2 4.5±0.3 0.063 5.1±0.4 5.6±0.5 0.093 36.2±0.2 46.3±0.3 0.037 GFP 组（n=6）8.1±1.0 11.5±1.2 0.046 2.7±0.2 2.9±0.2 0.068 2.1±0.1 2.2±0.1 0.077 25.1±0.2 36.2±0.2 0.035

石蜡切片免疫组化Col1 和SCX 检测结果见图2、图3、表3，与术后2 周相比，术后4 周，Col1及SCX 的表达均无显著变化（P＞0.05），相应时间点，四组间Col1、SCX 的表达定量从高到低依次为mTOR 干扰组＞GFP 组＞空白组＞mTOR 表达组（P＜0.05），差异均有统计学意义。

图2 四组髌腱损伤修复组织学观察（Col1 免疫组化，×100 μm）。2a, 2e: 空白对照；2b, 2f: mTOR 表达组；2c, 2g: mTOR 干扰组；2d, 2h: GFP 组。Figure 2. Histology of patellar tendon injury repair in four groups (Col1 immunohistochemistry, ×100 μm). 2a, 2e: Blank control. 2b, 2f:mTOR expression group.2c,2g:mTOR interference group.2d,2h:GFP group.

图3 四组髌腱损伤修复组织学观察（SCX 免疫组化×100 μm）。3a, 3e: 空白对照；3b, 3f: mTOR 表达组；3c, 3g: mTOR 干扰组；3d, 3h: GFP 组。Figure 3.Histology observation of patellar tendon injury repair in four groups(SCX immunohistochemistry×100 μm).3a,3e:Blank control.3b,3f:mTOR expression group.3c,3g:mTOR interference group.3d,3h:GFP group.

生物力学结果见表3，与术后2 周相比，术后4周四组最大损毁强度均显著增加（P＜0.05），相应时间点，最大损毁强度值从大到小依次为mTOR 干扰组＞GFP 组＞空白组＞mTOR 表达组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

mTOR 是一类大分子蛋白质，存在两种不同复合物形式，即mTORC1 和mTORC2［10，12］。mTORC1 由mTOR、RAPTOR 和mLST8 组成［3］。mTORC 1 在干细胞自我更新和分化方面也起到很重要的作用［4］。mTOR 整合细胞外多种信号刺激，参与体内多条信号通路［13，14］，影响转录及蛋白质合成，与细胞凋亡、自噬和生长等生命活动均有很重要的联系［15～17］。有研究表明使用mTOR 抑制剂可以延长寿命减缓衰老，说明mTOR 在衰老的过程中表达是增加的［18］。本研究通过检测青年和老年大鼠TSCs 中mTOR 及与其相关的蛋白表达，也发现mTOR、RAPTOR 在老年大鼠细胞中表达远远高于青年大鼠，从而证实了mTOR 的表达会随衰老而增强。众所周知，老龄化是导致肌腱损伤修复变得更加困难的一个重要因素，部分原因就是老龄化过程会使肌腱组织中的肌腱干细胞向肌腱方向分化的能力减弱［5］。mTOR 对于干细胞的自我更新和分化很重要，而且本实验结果提示老年大鼠的mTOR 蛋白表达相对青年大鼠增加，故此推断可能是mTOR 蛋白表达的增加抑制老年大鼠肌腱干细胞的成肌腱分化，从而导致老龄化肌腱损伤修复能力减弱。

有研究通过构建肌腱损伤模型，在病变部位植入自体或异体来源干细胞，调控干细胞的分化方向达到促进肌腱再生修复的作用［19～21］。Kokubu 等［22］将脂肪来源的干细胞注射到跟腱损伤模型缺损处，证明了脂肪来源的干细胞能够促进损伤跟腱的修复。从晓霞等［23］研究发现，AKT-mTOR 轴是肌腱分化关键调节信号，并为肌腱损伤和肌腱相关疾病提供了新的治疗靶点。本研究通过腺病毒转染将控制mTOR 蛋白表达的老龄大鼠TSCs 混合物植入大鼠髌腱缺损处建立髌腱缺损修复模型，通过调节mTOR 蛋白的表达来探索修复效果的差异。研究结果显示，HE 染色抑制mTOR 蛋白表达组中肌腱类似组织更多，其组织学评分、纤维结构评分均高于mTOR 蛋白过表达组。免疫组化结果也显示抑制mTOR 蛋白表达组Col1 表达均高于mTOR 蛋白过表达组。本研究的结果说明抑制mTOR 蛋白的表达能够促进老龄大鼠肌腱干细胞成肌腱分化，利于老年肌腱损伤组织的修复。

有研究发现，mTOR 蛋白的活性在肌腱组织损伤后出现改变，参与肌腱组织的修复过程［24］。另有研究发现，通过喂饲mTOR 蛋白抑制剂，可使损伤的肌腱组织在结构和生物力学上与成年小鼠的肌腱相似［25］。表明mTOR 蛋白参与了肌腱组织损伤后的修复过程。本实验生物力学研究结果显示，抑制mTOR蛋白表达后，修复的肌腱组织韧性更强，抗拉能力好，组织损伤修复效果相对较好。将来可通过对该信号通路进一步深入研究，明确其作用机制和下游的信号蛋白，为临床上使用药物抑制mTOR 蛋白的表达，来预防和治疗老龄化的肌腱损伤和肌腱病提供理论依据。

本研究局限性在于实验动物性别差异（雌性动物缺乏）、数量少、随访观察时间短。然而，本研究结果支持了这样的假设，即mTOR 蛋白调控TSCs 向成肌腱方向分化，可以调节老年大鼠肌腱损伤的修复。笔者认为，mTOR 蛋白在老化肌腱损伤修复中起着重要作用，但是精确分子机制尚不明确，有待进一步深入研究。