骨缺损修复生物材料诱导骨微环境中免疫应答机制的研究进展①

刘 潇 李 明

（中国人民解放军总医院第四医学中心骨科医学部，国家骨科与运动康复临床医学研究中心，北京 100853）

骨缺损是骨科医师面临的临床棘手难题，随着近年来骨组织工程技术的迅速发展，生物材料植入成为骨缺损修复最具潜力的治疗手段［1］。生物材料植入体内后，会立即引起免疫系统的异物排斥反应，植入的材料与血液相互作用在材料表面形成临时基质，包括纤维蛋白网络、血小板和炎症细胞，之后由炎症细胞触发急性炎症，特征为中性粒细胞或多形核白细胞的招募和激活［2-6］，多形核白细胞在降解材料的过程中会释放蛋白水解酶和活性氧，腐蚀材料的表面，并在48 h 后迅速衰竭凋亡［7］。与此同时，部分免疫细胞被招募到生物材料中，进一步诱发宿主和局部组织的炎症反应，这时宿主免疫系统中的单核细胞黏附于植入的生物材料表面，并分化为M1/M2 巨噬细胞［8-10］。巨噬细胞开始对生物材料进行吞噬和清除，在其周围形成纤维蛋白基质，进而形成纤维包膜包裹生物材料［4］，将其与周围组织分离，形成仅有机械支撑功能的惰性材料，割断了骨微环境中骨髓与材料间的相互作用，成骨细胞无法附着材料表面形成新骨，而此时骨缺损部位完全被纤维组织填充，最终导致植入材料无法降解、新骨无法长入替代，骨缺损修复失败［11］。

近年来随着骨免疫在骨再生领域的研究不断深入，研究者逐渐发现在局部骨微环境的形成中，生物材料植入体内后引起局部骨微环境中免疫应答的变化是决定诱导成骨、骨重塑成功与否的核心因素之一［12-13］。良好的免疫应答可通过调节生长因子、趋化因子、炎症因子等多种因子表达，调控骨再生中成骨分化、破骨分化、纤维化和血管化等多个与骨再生密切相关的过程，在骨再生过程中发挥关键作用［14］。因此，本文就主要参与骨移植材料微环境中免疫应答的免疫细胞和细胞因子间的作用机制进行综述，从而明确骨微环境免疫应答调控缺陷的关键难题，进而为开发具有良好骨免疫调节特性的生物材料提供一些启示与思考。

1 免疫细胞在骨微环境免疫应答中的作用和机制

1.1 中性粒细胞 生物材料植入体内后，临时基质中的炎症细胞立即招募中性粒细胞对生物材料进行吞噬降解，中性粒细胞成为最先被激活到达材料周围血液中的免疫细胞［4］，然后分泌趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和巨噬细胞炎性蛋白-1β（macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β），诱导募集单核巨噬细胞到达损伤部位［3，15］。一些学者也认为早期炎症中性粒细胞的浸润和分泌趋化因子的行为是骨微环境中控制骨折愈合的关键限速步骤［16］。此外，中性粒细胞也可表达NF-κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL），并通过RANKL/NF-κB 受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/骨保护素（osteoprotegerin，OPG）通路调节破骨细胞生成，触发骨吸收调节［17］。还有研究表明中性粒细胞还可通过在骨折后48 h 内快速合成纤维连接蛋白促进骨折愈合［18］。中性粒细胞的募集与蛋白质和巨噬细胞在生物材料上的募集吸附密切相关，影响材料的生物相容性，因此调控中性粒细胞功能成为生物材料设计的重要关注点。

1.2 单核/巨噬细胞 单核/巨噬细胞是生物材料诱导免疫应答中最重要的效应细胞之一，材料植入体内后立即启动急性炎症反应，急性炎症后单核细胞黏附于损伤部位，并分化为巨噬细胞和多核巨细胞进入慢性炎症过程，巨噬细胞可随着骨微环境的变化而改变为不同表型，这种表型变化对骨缺损修复的成败具有至关重要的作用［19-20］。一般来说，巨噬细胞表型分为M1 型（经典活化）和M2 型（交替活化），M1表型被称为促炎型，产生一系列促炎细胞因子、趋化因子等，通过诱导骨微环境的炎症反应保护组织免受外来物质的侵袭，同时上调RANKL 增强破骨细胞分化和骨吸收［21］；而M2 表型被称为抗炎型，产生抗炎细胞因子，抑制炎症，并促进血管生成、组织愈合和骨组织的再生［4］。值得注意的是，巨噬细胞表型的变化并不是单纯从M1 向M2 的变化，而是在不同的免疫应答过程中形成不同比例的混合表型［22］。目前研究普遍认为理想的生物材料应当充分诱导M1 向M2 转换，减轻炎症反应，促进骨组织重建修复［23-24］。但也有文献报道，过度激活M2型巨噬细胞会增加促纤维化因子（TGF-β1、TGF-β3等）释放，反而导致生物材料被炎性纤维组织包裹而修复失败［25-26］。因此只有充分理解巨噬细胞表型在不同免疫应答阶段的变化规律，才能更好地调控骨微环境向有利于成骨的方向变化，进而促进骨愈合，修复骨缺损。

1.3 淋巴细胞 淋巴细胞包括T 淋巴细胞和B 淋巴细胞，在骨微环境中承担不同功能。生物材料植入后，随着时间的推移，由急性炎症逐渐转变为慢性炎症，慢性炎症激活的T 细胞可增强骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的成骨分化，参与慢性炎症下的骨再生［27］。T 细胞也分为不同亚群，其中Th1和Th2均通过分泌INF-γ和IL-4抑制破骨细胞形成，而Th17 细胞和Th17 相关细胞因子可导致RANKL 水平明显升高，诱导破骨细胞形成［28］。另一方面，CD4+T 细胞通过IL-4、IL-10 和CTLA-4 抑制破骨细胞分化，NKT 细胞表达巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，MCSF）和RANKL 诱导破骨细胞形成［29］。B 淋巴细胞是骨髓源性OPG 的主要来源，约占64%［30］。B 淋巴细胞产生的OPG在Th1细胞因子存在的情况下抑制破骨细胞功能，并通过Th2 细胞因子发挥催化作用。B 淋巴细胞与T 淋巴细胞通过CD40/CD40L 共刺激通路协同上调OPG，因此B 淋巴细胞被认为是破骨细胞形成的主要抑制剂之一［31］。总体而言，当前对于淋巴细胞在骨再生中的作用研究尚缺乏，鲜有文献阐明不同阶段T 淋巴细胞和B 淋巴细胞在骨再生中的具体作用，该领域有待进一步探索［16］。

1.4 其他免疫细胞 还有一些免疫细胞也参与了骨微环境中的免疫调控，包括肥大细胞和树突状细胞（dendritic cells，DCs）等。肥大细胞主要参与破骨细胞形成，因此肥大细胞数量的增多会导致骨丢失增加，而肥大细胞数量减少则会影响骨重塑［32-34］。DCs 影响T 淋巴细胞的免疫功能，成熟的DCs 可激活并上调Th17 细胞促进破骨形成［35］。与此同时，DCs 在与CD4+T 细胞的相互作用中，通过MCSF 和RANKL 通路转分化为破骨细胞［36］。另一方面，DCs可以摄取抗原（例如坏死的组织和细胞、引起蛋白质构象变化的生物材料等），然后将其呈递给T淋巴细胞，同时释放细胞因子，改变局部免疫微环境，调控下一步的抗原特异性免疫反应［37-38］。当前对于这些免疫细胞发挥成骨调节作用的详细过程报道较少，对其在骨免疫应答不同阶段所起的调节作用仍有待进一步研究。

2 细胞因子在骨微环境免疫应答中的作用和机制

2.1 促炎细胞因子 生物材料植入体内后诱导的代表性促炎细胞因子包括TNF-α、IL-1α/β和IL-6［39-40］，这些细胞因子主要由促炎M1 巨噬细胞分泌，多种促炎细胞因子间的交叉作用在维持早期骨免疫环境、招募MSCs 至骨缺损部位、刺激MSCs 增殖和分化等方面极为重要［16］。其中TNF-α、IL-1α/β 和IL-6可通过RANKL/RANK/OPG 系统增强破骨细胞分化和吸收活性，抑制成骨细胞活性和骨形成［22，41］。但有研究表明，低剂量的TNF-α（1 ng/ml）可将肌源性基质细胞招募到骨缺损部位，增强其成骨分化，促进骨修复［42］。促炎细胞因子含量在高表达几天后迅速下降，值得注意的是，TNF-α 和IL-1β 的表达水平呈现双峰模式，即在炎症初期前24 h 和骨重塑末期出现高峰［43］。另一些研究则表明在早期炎症中，低剂量的TNF-α 和IL-6 能促进MSCs 向损伤部位招募，并刺激其向成骨细胞分化，有利于新骨的形成［44-45］。而持续性炎症时这些促炎细胞因子则会发挥其原本的促破骨抑制成骨作用，对骨再生产生负面影响［46］。SCHMIDT-BLEEK 等［47］对正常和延迟骨愈合模型中细胞因子分泌谱进行的研究表明，延迟骨愈合模型中促炎细胞因子较正常骨愈合模型显著增加。因此笔者认为在生物材料诱导的骨微环境中，早期促炎因子低剂量释放有利于MSCs 的招募，促进成骨；而促炎因子高剂量释放或持续释放导致的长期炎症环境则阻碍成骨。提示骨微环境中不同细胞因子、免疫细胞、成骨/破骨细胞、MSCs的相互作用需要动态的视角进行认识与分析。

2.2 抗炎细胞因子 生物材料植入体内后诱导的代表性抗炎细胞因子包括IL-1RA、IL-4、IL-10、TGF-β，除IL-4 外，这些细胞因子主要由抗炎型M2巨噬细胞分泌［4］。IL-1RA 是IL-1（促炎细胞因子）的抑制剂，通过调节IL-1 的成骨不良作用促进骨形成［39］。IL-4也是巨噬细胞M2表型的强诱导因子，可加速成骨细胞增殖，但一定程度上会抑制成骨细胞分化，而IL-10 则可增强成骨细胞分化，并具有抗破骨细胞作用［26，39，48］。CHA 等［49］通过对IL-4 诱导三维水凝胶中M2 巨噬细胞的研究认为，不良免疫反应是导致生物材料植入和临床转化失败的关键因素，尽管炎症是组织再生的重要组成部分，但慢性炎症的产生最终会导致骨修复失败。HACHIM 等［50］进行的体外实验证明IL-4 涂层处理的生物材料促进了M2 表型的极化，体内研究实验证明，在免疫应答的早期阶段，使用IL-4涂层植入物的小鼠在组织-植入物界面的M2 巨噬细胞百分比增加，M1 巨噬细胞百分比减少，促进早期巨噬细胞向M2 转化，有利于生物材料周围纤维包裹的减少和后期骨整合能力的改善。TGF-β 是骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路的上游成骨细胞因子，能诱导MSCs 向成骨细胞分化［51］。与此同时，TGF-β还是纤维化过程中的关键细胞因子，通过成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor-2，FGF-2）/细胞外调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）途径诱导成纤维细胞增殖［52］。综上所述，生物材料介导的骨微环境中的抗炎细胞因子对成骨多发挥有利作用，但TGF-β 的过表达可能导致材料表面纤维化，形成纤维包裹，影响后期的骨整合，因此将TGF-β 作为减少纤维化的靶点细胞因子可能成为未来生物材料设计的关键点。

2.3 其他细胞因子 另一些细胞因子也被报道参与生物材料诱导的骨微环境免疫调控，通过调节成骨与破骨平衡、骨重塑等途径对骨缺损修复产生影响。MSCF 由成骨细胞表达，通过Akt 和MAP 激酶途径与受体（c-Fms）结合，刺激RANK 表达，诱导破骨前细胞分化，调节破骨细胞的存活和凋亡［53］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是内皮细胞高度特异性的有丝分裂原，与酪氨酸激酶受体结合导致内皮细胞增殖、迁移和新血管生成，是骨再生过程中最重要的血管生成因子之一［54］。研究表明，VEGF 在各种动物模型中通过耦合调节骨生成与血管生成实现骨再生［55-56］。IL-33是破骨细胞的抑制剂，与IL-4 结合后可促进单核细胞向DCs 和巨噬细胞分化，抑制破骨前体细胞和破骨细胞分化，干扰破骨细胞形成［57-58］。其他细胞因子如IL-10、IL-17、IFN 家族等也通过不同途径在骨再生中发挥重要作用。IL-10 可通过干扰活化T 细胞胞浆核因子表达抑制骨吸收，而核因子是破骨细胞分化的重要因素［59］。IL-17可引起局部炎症、刺激RANKL 表达，并通过诱导TNF-α和IL-1激活破骨前体细胞［60］。IFN家族主要包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ，均可抑制破骨细胞分化［61］。除上述细胞因子外，IL-11、IL-8、CXCL12、CCL2 也可能参与破骨细胞的形成［57，62-63］。但目前对于这些细胞因子在骨免疫微环境中的相互影响和具体机制报道较少，尚待进一步研究。

3 发展与展望

目前的研究虽然对骨微环境中免疫应答的机制有了一定的了解，但许多问题仍然没有解决，一些免疫细胞和细胞因子的作用机制尚未阐明，研究者需要进一步探索不同免疫细胞在免疫调控不同阶段的动态变化，深入理解各种免疫细胞因子在不同修复时期发挥的作用和相互影响。本团队认为诱导新骨生成和实现完整功能的新骨填充骨缺损部位的关键点应该在合理调节巨噬细胞功能上，包括抑制炎症性巨噬细胞活性、促进巨噬细胞向M2型极化，其他免疫细胞和细胞因子应动态协同调控该过程，进而改善局部微环境的成骨效应，增强骨整合并促进新骨形成。同时由于免疫细胞具有自分泌、旁分泌特点，应将骨微环境中参与免疫应答的免疫细胞和细胞因子看作一个彼此独立、相互影响的整体进行评估和分析。当前生物材料正在从传统诱导免疫耐受的惰性材料向诱导主动免疫应答并具有“免疫调节”能力的生物材料方向发展。阐明生物材料诱导的骨微环境中的免疫应答机制是突破当前材料的“免疫应答调控缺陷”瓶颈的“金钥匙”，探索材料“适度诱导”免疫调控、“精准调控”目标因子、与不同阶段的免疫微环境“交互反馈”及对成骨和破骨细胞实时“动态调控”的改性策略将是未来材料的研究方向。随着学者们的深入研究与不断探索，利用具有主动免疫调节特性并且能根据不同阶段骨微环境变化而自主响应的“智能化”生物材料，实现新骨的再生和临界尺寸骨缺损的良好修复终将成为现实。