2022年济南市3株输入性新型冠状病毒奥密克戎BQ.1全基因组特征分析

白 飒,刘保华,闫荣军,赵 辉,孙连波,张 涛,韩焕美

2019年12月发现的新冠肺炎疫情(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的一种呼吸道传染疾病,是继人冠状病毒229E(HCoV-229E)[1]、HCoV-OC43、急性严重呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、HCoVNL63[2]、HCoV-HKU1[3-4]和中东呼吸综合征冠状病毒(MERSCoV)[5]后第7种能感染人类的冠状病毒。因其传播速度快、传染性强等特性被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)宣布成为“国际公共卫生紧急事件”,2020年3月WHO将COVID-19定义为全球性大流行病[6-10]。疫情造成的死亡人数已远超2003年SARS大流行,对全球的健康、经济和社会造成沉重的负担[11-12]。

SARS-CoV-2为单股正链RNA病毒,基因组全长约30 kb。随着病毒的持续流行,SARS-CoV-2目前已经进化出多种基因型和进化分支。本研究对3例输入性新冠肺炎病例的呼吸道标本开展核酸检测和二代高通量全基因组测序,并对基因序列进行变异分析和同源性分析,从分子流行病学角度为济南市新冠疫情防控工作提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》中新冠病毒样本采集和检测技术指南[13],对济南口岸入境的SARS-CoV-2 无症状感染者采集鼻咽拭子样本,编号分别为样本1-RJ091,样本2-RJ034,样本3-RJ136。

1.2 仪器和试剂 GeneRotex 96 全自动核酸提取仪和病毒RNA提取试剂均购自西安天隆科技有限公司;新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)分别购自上海伯杰医疗科技有限公司、江苏硕世生物科技股份有限公司、武汉明德生物科技股份有限公司;ABI QuantStudio Q3/Q5以及台式荧光计-Qubit4均购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific);DNBSEQ-E5基因测序仪,测序试剂DNBSEQ-E5RS Sequencing Kit(SE100)及集成测序载片DNBSEQ-E5RS Integrated Flow Cell均来自于深圳华大智造科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 核酸提取与检测 从鼻咽拭子样本中吸取200 μL进行核酸提取,取5 μL用于新冠病毒ORF1ab和N靶基因的检测,具体操作步骤详见商品化试剂盒说明书。

1.3.2 基因测序 取提取的目标样本核酸10 μL,通过ATOPlex RNA 多重PCR扩增模块(华大智造,货号:940-000132-00)、MGIEasy Fast酶切DNA文库制备试剂套装(华大智造,货号:940-00029-00)、高通量测序试剂盒套装(SE100,货号:940-000335-00)、DNBSEQ一步法DNB制备试剂盒(OS-DNB)(华大智造,货号:1000026466)完成病毒RNA的反转录、多重PCR、纯化、定量等文库制备以及OS-DNB的制备等步骤。DNB终浓度≥8 ng/μL后通过集成测序载片(华大智造,货号:1000026251)上机测序。按照华大智造公司测序流程说明书进行测序。

1.3.3 基因组分析数据库的建立 通过生物学分析软件CLC Genomics Workbench 23.0.4(QIAGEN,Germany)对已测序列进行优化及序列拼接。使用在线分析平台pangolin https://pangolin.cog-uk.io/ 对测得的病毒全基因组序列进行毒株分型,Nextclade(https://clades.nextstrain.org)对其进行变异位点分析。本研究采用SARS-CoV-2 isolate Wuhan-Hu-1(GenBank: MN908947.3)作为新冠病毒参考基因组进行分析,同时从GISAID和NCBI数据库中筛选出与所测序列相似性高,同时期国际上公布的序列作为同源性分析的参考基因组,共37条序列通过MEGA7.0(MasatoshiNei,University of Pennsylvania)软件分析,最大似然法构建系统进化树,用bootstrap抽样1 000次来评估进化树的可靠性。

2 结 果

2.1 核酸检测结果 通过RT-PCR法,对样本1-RJ091、样本2-RJ034、样本3-RJ136的核酸提取物进行双试剂检测,结果显示双靶标(ORF1ab基因和N基因值)扩增曲线均呈标准S型且有明显指数增长期(阳性),第三方质控品、试剂盒中阳性标准品、阴性标准品以及环境监测样品均符合试剂盒结果判读要求。

2.2 测序结果 3份样本经二代全基因组测序,测序质量值(Q30)分别为95.92、95.43、98.34,基因组测序深度分别为5730.77X、2223.97X、2965.59X,拼接后有效全长在29 835 bp～29 844 bp之间;与标准参考序列SARS-CoV-2 isolate Wuhan-Hu-1)比对,基因组覆盖率(完整度)分别为99.75%、99.75%、99.65%,覆盖一致性数据较好。

2.3 病毒突变分析 与参比毒株SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1相比,测序结果显示3例样本基因组变异涉及8个编码区域,其中导致S基因编码区氨基酸变异的有32～33个,占总突变的50%以上,ORF1基因上的非同义突变数为18～20个,占总突变的30%以上。其余编码区(包括E、M、N基因)的突变数仅有10个,N基因占比50%左右。结合图1,可发现3个样本序列在S编码区均出现了K444T、L452R、N460K、F486V等重要位点的变异,其中病例1和2还出现了R346T的变异。基因组位点详细变异情况见表1。

表1 3例病例的基因组位点变异情况

图1 SARS-CoV-2变异位点进化图[19])

2.4 系统进化分析 应用pangolin分型法及Nextstrain在线平台对病毒进行分析,分型结果显示,3例不同区域输入的新冠病毒均位于BA.5.3.1进化分支上,Nextstrain分型为22E,样本1-RJ091为奥密克戎变异株BQ.1.22,样本2-RJ034为BQ.1.1,样本3-RJ13为BQ.1。利用MEGA7.0软件构建SARS-CoV-2全基因组序列进化树,在进化树上,3例新冠病毒样本与来自日本的参考株BS006451.1、EPI_ISL_18006411聚成一簇,与同时期日本公布的核苷酸序列相似性最高,遗传距离最近,同属于BQ.1分枝。系统发育树详见图2。

●为参考基因组Wuhan-Hu-1株▲sample_1为样本1-RJ091, ▲sample_2为样本2-RJ034, ▲sample_3为样本3-RJ13。

3 讨 论

自从2019年12月新冠肺炎出现后,携带Spike蛋白D614G的SARS-CoV-2变体迅速成为全球大流行中最普遍的株型[14],经过全球不同人群间的传播进化以及新冠药物及疫苗的多重选择下,新的变种不断出现,感染病例不断攀升,新冠肺炎已然成为了全球范围内最重大的公共卫生事件之一[15]。研究表明,SARS-CoV-2基因组平均每月积累2个碱基突变[16]。持续深入的病毒基因组监测和实时评估新出现的 SARS-CoV-2 变体的风险至关重要。

本研究通过二代测序技术对同一时间段不同地区入境的3株新型冠状毒株进行测序并成功获得了相应的全基因组序列。Pangolin 分型结果显示,3例新冠病毒序列均为Omicron变异株,位于BA.5.3.1进化分支上,基因型分别为BQ.1.22,BQ.1.1,BQ.1。BQ.1是BA.5通过变异变迁形成了第6代的一个亚分支。3例样本与同时期日本公布的核苷酸序列相似性最高,遗传距离最近,同属于BQ.1分支,提示可能跟日本2022年10月开始流行的BQ.1同源。此次全基因组系统发育分析中可发现SARS-CoV-2在全球范围内持续稳定的传播,世界范围内高密度人群流动可使病毒在短时间内扩散,符合该毒株在该时期的上升趋势[17]。

通过对全基因组变异位点分析以及与Wuhan-HU-1参考序列对比,3例样本分别产生了77、80、78个碱基位点突变,氨基酸突变数分别为60、63、59,以S编码区氨基酸突变频率最高,ORF1(ORF1a和ORF1b)编码区上的突变次之,其余编码区(包括E、M、N基因)最少。由于S蛋白是宿主和治疗性抗体作用的重要位点,通过受体结合区(RBD)与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)结合导致细胞感染[18],因此S蛋白的变异位点对病毒感染性有着重要影响。3例毒株序列在S刺突蛋白的5个关键残基处均集中获得趋同替换K444T、L452R、N460K 和 F486V的变异,其中病例1和2还出现了R346T的变异,均属于BQ.1亚系毒株特征性变异位点[19]。所有5个趋同替换都有助于增加相对基本繁殖数,而包含所有5个趋同替换的 BQ.1.1 在所研究的病毒中表现出最高的适应性[20]。Fabio S等在中和试验研究中发现,BQ.1.1比BA.5更能突破BA.2/5感染血清,BQ.1.1 刺突蛋白比 BA.5 刺突蛋白表现出更大的融合性,这些重要位点的突变是导致免疫逃逸的关键[21]。此外,BQ.1 取代 BA5.2 在刺突蛋白上的受体结合结构域,该位点是COVID-19 疫苗和治疗性单克隆抗体(mAbs)的主要靶点,因此这些迅速增加的亚变异及广泛的刺突突变可能对当前某些治疗性抗体产生耐药性。研究表明,临床批准的 LY-CoV1404 (bebtelovimab)和Evusheld对 BQ.1 或 BQ.1.1 无效[22],这引起了人们的担忧,即单抗或疫苗对 BQ.1.1 的效果可能不如其他奥密克戎菌株。

由于冠状病毒亚变体 BQ.1 在逃避抗体方面的优势使其比原始的Omicron变体更容易传播,因此,可能会导致突破性感染和部分人重复感染,BQ.1.1 已在全球占据过主导地位,但到目前为止,没有实质性证据表明 BQ.1及其分支比原来的奥密克戎变体引起更严重的疾病[19]。虽然我国已经取消了清零政策,但是新变异株的不断出现一直吸引着人们的极大关注。截至目前 BA.5.2 及 XBB 是我国的主要流行毒株,BQ 毒株未成爆发之态,一方面可能跟毒株本身没有导致致病性增强的变异位点有关,另一方面可能跟我国的防疫政策,医疗环境等有关系,但这个亚系仍在不断进化和传播,使得棘突突变的复杂性也在不断增加,由奥密克戎毒株引起的突破性感染可交叉中和 BQ.1、BQ.1.1 和 XBB.1.5 毒株等大量新毒株的血清样本[20-22],二者融合现象越来越突出,形成“共循环”,未来的亚变体应该会综合 BQ.1.1.*与 XBB.1.5的突变的优势,形成终极的突变模式,这种复杂模式为疫情发展走势带来很大的不确定性,外防输入仍然面临考验、挑战和压力,我们仍需密切关注全球疫情形势和病毒变异情况,防范病毒卷土重来。

本研究通过测序获得的3例境外输入性新冠病毒变异株 OmicronBQ.1及其分支,为济南口岸首次检出的输入性新冠病毒基因型,丰富了济南市SARS-CoV-2变异株的数据库,为潜在的疫情溯源提供了基础资料。

利益冲突：无