河南不同产区烤烟代谢物区域特征分析

周汉红，孙书斌，罗先学，肖金胜，甘 韬，方武军

（1.湖北中烟工业有限责任公司，武汉 430040；2.湖南省烟草专卖局张家界市公司，湖南 张家界 427000）

河南产区烤烟年生产量在10 万t 以上，是全国重要的浓香型卷烟优质产区，在卷烟品牌中发挥重要的配方作用，但河南各产区空间跨度大，土壤和气候条件也存在较大区别，导致烟叶风格在产区间存在一定的差异。学者对河南烟叶进行了大量研究，但主要集中在施肥、烘烤等烟叶生产方面［1-5］以及物理特性、化学成分等质量方面［6-13］，对各产区烟叶代谢物质方面的研究比较少。

烟叶在成熟和烘烤过程中存在一系列复杂的生化反应，其中代谢物的种类和含量对烤烟的感官质量有重要的影响［14］。非靶向代谢组学旨在通过考虑数据集中存在的所有信息，在生物系统中收集尽可能多的代谢物的信息，广泛应用于植物代谢组学分析。其主要技术有液相色谱-质谱联用（LC-MS）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）等［15-17］，其中液相色谱-质谱联用（LC-MS）具有可靠的灵敏度、较高的精度和分析方法的鲁棒性，是灵敏度和选择性的最佳组合，因此在大多数代谢组学方法中必不可少。本研究运用液相色谱-质谱联用（LC-MS）方法对河南省驻马店市泌阳县、南阳市社旗县、信阳市罗山县、洛阳市宜阳县和三门峡市卢氏县5 个产区的C3F 进行非靶向代谢组学分析，探索不同产区烟叶的关键差异代谢产物差异，旨在更好地指导烟叶生产和工业调拨。

1 材料与方法

1.1 试验样品

试验对象为河南省驻马店市泌阳县、南阳市社旗县、信阳市罗山县、洛阳市宜阳县、三门峡市卢氏县5 个产区2021 年的C3F 样品（表1），把刚调制完下炕的烟叶样品立即放入液氮中冷冻，样品邮寄到北京诺禾致源科技股份有限公司实验室，-80 ℃冰箱中储存备用。

表1 样本详情

1.2 试验仪器

本试验委托北京诺禾致源科技股份有限公司检测。Q Exactive™HF-X 质谱仪、Vanquish UHPLC 色谱仪，德国赛默飞世尔科技公司；Hypesil GOLD Column 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），美国赛默飞世尔科技公司；D3024R 型低温离心机，美国Scilogex品牌。甲醇、甲酸、醋酸铵均购于美国赛默飞世尔科技公司，超纯水购于德国Merck 公司，以上试剂纯度均为色谱级。

1.3 试验设计

本项目基于液质联用（LC-MS）技术进行非靶向代谢组学研究，试验设计主要包括样本的代谢物提取、LC-MS/MS 检测以及数据分析等。由于同一种代谢物可能带正电荷或者负电荷，所以分别对带正电荷和负电荷的代谢物进行检测和分析。

1.4 数据处理与分析

首先将质谱检测得到的原始文件（.raw）导入Compound Discoverer 3.1（CD）软件进行谱图处理及数据库搜库，得到代谢物的定性定量结果，然后对数据进行质控，保证数据结果的准确度、可靠性。再对代谢物进行多元统计分析，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）等，揭示不同组别代谢物的差异。利用层次聚类（HCA）和代谢物相关性分析，揭示样本之间及代谢物之间的关系。最后，通过代谢通路等功能分析解释代谢物相关的生物学意义。

2 结果与分析

2.1 各区域C3F 等级烟叶代谢组的多元统计分析

为了探究C3F 代谢物在泌阳县、社旗县、罗山县、宜阳县和卢氏县的区域特征，对烘烤后的烟叶进行代谢组测序和分析。正离子代谢物和负离子代谢物的主成分分析结果如图1 所示。由图1 可知，5 个地区间的烟叶代谢物特征差异明显，但各地区内部样本差异较小，且分离趋势均处在95%置信区间内。比较5 个地区发现，泌阳县和社旗县的烟叶代谢物主成分比较相近，宜阳县和卢氏县的烟叶代谢物主成分比较相近，而罗山县与其他地区的烟叶代谢物主成分相对差异较大。

图1 带正电荷代谢物（a）与带负电荷代谢物（b）主成分分析结果

2.2 主要代谢物及各区域特异代谢物表达分析

基于所有代谢物的表达丰度数据，利用单因素方差分析对样本组间进行差异比较，按照标准差（s）进行排序，以P＜0.05 为阈值，对代谢物进行差异表达的筛选，得到各区域差异表达代谢物数量（表2），泌阳县、社旗县、罗山县、宜阳县和卢氏县的差异代谢物分别为477、411、319、186 和227 种，其中差异代谢物为正离子代谢物和负离子代谢物总和。图2 为差异表达代谢物可视化热图，由图2 可以看出，泌阳县和社旗县的差异代谢物的丰度比较相似，宜阳县和卢氏县代谢物比较相似（黑框标识）。基于差异代谢物丰度，通过皮尔森相关性分析（表3）发现，泌阳县和社旗县、宜阳县和卢氏县烟叶代谢物相关性较高（P＜0.05）。

图2 差异表达代谢物丰度可视化结果

表2 各区域差异表达代谢物数量（单位：种）

表3 各区域烟叶代谢物皮尔森相关性分析

基于以上差异分析的结果，得到前20 种差异表达正离子代谢物（表4）和前20 种差异表达负离子代谢物（表5）。其中前20 种差异表达正离子代谢物包括14 种酸，分别为DL-色氨酸、葡萄糖酸、柠檬酸、L-苏糖酸、琥珀酸、水杨酸、富马酸、D-α-羟基戊二酸、2R-2，3-二羟基丙酸、DL-4-羟基苯乳酸、柠康酸、2-羟基己酸、N-乙酰基-D-别异亮氨酸和N-乙酰-DL-丙氨酸；1 种亚胺；1 种酚；1 种醇；1 种酰胺和2 种内酯。前20 种差异表达负离子代谢物包括7 种酸类，3 种碱，2 种酮等物质。

表4 前20 种差异表达正离子代谢物

表5 前20 种差异表达负离子代谢物

图3 为葡萄糖酸、L-苏糖酸、富马酸、D-甘露醇、D-谷氨酰胺、N-乙酰基-D-别异亮氨酸的丰度柱状图。通过L-苏糖酸和富马酸的丰度图可以看出，其在泌阳县和社旗县的丰度比较相近。结果支持本文前述猜想。

图3 6 种差异代谢物丰度

2.3 基于KEGG 数据库的代谢通路分析

为确定5 个区域C3F 等级烟叶差异代谢物的主要生物学功能，对这些差异代谢物进行了KEGG 通路富集分析（以P≤0.05 为阈值），如图4 所示。结果表明，差异代谢物主要富集在氨基酸代谢相关通路中。图5 以三门峡市卢氏县C3F 等级烟叶为例，色胺酸代谢通路表达差异最显著，该条代谢通路富集到的差异代谢物为吲哚和吲哚酚，主要集中在吲哚和吲哚酚生物合成上（图6）。

图4 KEGG 通路富集分析

图5 三门峡市卢氏县C3F 等级烟叶KEGG 富集气泡

图6 富集差异代谢物代谢路径

3 结论

1）泌阳县和社旗县烟叶代谢物相关性比较高，宜阳县和卢氏县相关性比较高，罗山县与其他区域代谢物均相差较大。可见地理位置相近，气候相近，代谢物相关性高；地理位置远，气候相差较大，代谢物相关性低。

2）KEGG 富集结果显示，差异代谢物主要富集在氨基酸代谢相关通路中。以三门峡市卢氏县C3F等级烟叶为例，以色氨酸为底物合成吲哚和吲哚酚生物合成途径是三门峡市卢氏县C3F 等级烟叶差异最显著的代谢途径。