循环肿瘤DNA在消化系统肿瘤中的应用

于明鑫 杨爱明

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院消化内科,北京 100730)

目前我国常见的肿瘤标志物如癌胚抗原、CA19-9对于消化系统肿瘤的敏感性和特异性均不高[1]。液体活检主要包括血浆游离DNA(circulating free DNA, cfDNA)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)、微小RNA(microRNA, miRNA)、外泌体(exosome)。液体活检的检测标本来源较广,包括血液、尿液、脑脊液、胸腔积液、腹腔积液、唾液等体液[2]。1948年,Metais和Mandel[3]首次发现血液中片段的DNA,即cfDNA。1994年, Caldas等[4]首次在胰腺癌患者cfDNA中检测到存在KRAS突变,证实了携带突变信息的cfDNA来自于肿瘤细胞。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)属于cfDNA的一种,是指由肿瘤直接分泌,或通过凋亡或坏死的肿瘤细胞释放,也可由外泌体释放。循环肿瘤DNA作为指导临床决策的生物标志物,应用于消化系统早期癌症的筛查和诊断、指导治疗、监测治疗效果、分析术后残余病灶及预防疾病复发等方面[1, 5]。本文主要对ctDNA的生物学特征、检测方法以及其在消化系统肿瘤中的应用进行阐述。

1 ctDNA的生物学特性

ctDNA是由原发肿瘤细胞、原发肿瘤组织及转移灶通过凋亡或坏死的肿瘤细胞释放到血液中,或由肿瘤直接分泌释放到血液中。ctDNA是携带肿瘤突变片段的cfDNA,含有肿瘤特异性基因特征和表观遗传学特征,且具有较高的组织和细胞类型特异性,可作为生物标志物。ctDNA检测与传统肿瘤标志物检测方法相比,具有简单、实时、微创、可重复的优势[6]。ctDNA携带的肿瘤基因组信息与肿瘤组织所携带的肿瘤基因组信息一致,因此ctDNA检测可以克服肿瘤异质性的相关问题。ctDNA存在单链DNA、双链DNA或单双链混合DNA等形式,可见于血液、脑脊液等体液。不同形式产生的ctDNA大小不同,通过细胞凋亡产生的ctDNA片段大小一般在70～200 bp,通过细胞坏死产生的DNA通常在200 ～ 21 000 bp。因血液中的ctDNA半衰期较短,一般为15 min ～ 2 h,其迅速通过循环酶、巨噬细胞等多种方式降解,故可首选血浆ctDNA用于实时监测。

ctDNA携带肿瘤特异性基因特征和表观遗传学特征,包括基因突变、染色体重排、拷贝数变异和甲基化改变等。甲基化修饰在肿瘤形成早期发生,同时甲基化修饰具有组织特异性,故通过检测血液中ctDNA的甲基化可实现早期癌症的筛查和诊断。

2 检测方法原理及特点

ctDNA含量较少,仅占cfDNA的0.01%,检测ctDNA需要高灵敏度、高通量的检测技术。目前常用的检测技术包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)和二代测序(next generation sequencing, NGS)[7]。

2.1 PCR

2.1.1 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)

qRT-PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前大多数商品化的ctDNA检测试剂盒的原理都是基于qRT-PCR技术,如TherascreenTMEGFR plasma RGQ PCR试剂盒(Qiagen公司,德国)、cobas EGFR Mutation Test v2试剂盒(Roche公司,瑞士)和Super ARMS EGFR检测试剂盒(中国艾德生物)。基于qRT-PCR的检测技术检测灵敏度达到了98%～100%,特异度达到了99.9%～100%。该检测方法优点是操作简单,成本低,缺点是通量低、无法检测未知突变[8]。

2.1.2 数字PCR(digital PCR, dPCR)

dPCR的原理是将一个样本充分稀释,分配到不同的反应单元,每个单元包含少于或等于一个拷贝的目标分子,在每个反应单元中进行单独、平行的PCR反应,不同于qRT-PCR对每个循环进行实时荧光测定的方法,dPCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集,通过将PCR扩增的指数性质转化为线性呈现,以提高检测灵敏度,实现绝对定量及稀有等位基因的检测。根据稀释策略的不同分为微腔或微滴式。其中基于液滴的数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)利用分散在油中的水滴作为PCR反应单元,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度,检测灵敏度可达到0.1%以上。dPCR检测方法成本低,灵敏度高,是ctDNA 使用最广泛的检测技术之一。缺点是检测通量低且不能检测未知突变[9-10]。

2.1.3 BEAMing(bead, emulsion, amplification, magnetics)

BEAMing结合数字PCR与流式技术,通过磁珠克隆DNA。利用特异性PCR 引物扩增目标突变区后,与磁珠(磁珠上固定有特异的PCR 引物)混合进行油包水单分子扩增反应。反乳化作用后,利用荧光探针结合磁珠上的PCR 产物,发出不同颜色荧光。使用流式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况。BEAMing技术的应用实现了低至0.01%的肿瘤实变的超敏检测。但BEAMing技术操作程序复杂,且存在通量低及不能检测未知突变的缺陷[10]。

2.2 NGS

NGS技术可对未知突变基因进行筛查,具有高通量、高特异度、高精度的特点, 可用于肿瘤早期诊断、分析术后残余病灶及预防疾病复发,但在低浓度标本、低频突变中仍需提高灵敏度。Liu等[11]曾通过NGS技术检测结直肠癌中的单核苷酸变异数(single-nucleotide variation, SNV)证实了NGS可用于追踪原发和转移病灶。

2.2.1 全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)和全外显子测序(whole exome sequencing, WES)

WGS和WES技术通过评估整个肿瘤基因组或外显子区,可以从头识别分子改变,包括拷贝数变异、结构重排和单核苷酸取代。其优势在于检测通量高且能检测未知突变。但因为等位基因频率低于5%的检测覆盖率相对较低,导致WGS和WES分析ctDNA中罕见突变的灵敏度低且成本较高[12]。

2.2.2 全基因组亚硫酸氢盐测序(whole genome bisulfite sequencing, WGBS-Seq)

血浆中甲基化对于癌症的诊断灵敏度为74%,特异度为94%,具有较好的癌症诊断应用价值。WGBS-Seq是DNA甲基化分析的金标准。其原理是用重亚硫酸盐处理,将基因组中未发生甲基化的 C 碱基转换成 U,进行PCR扩增后变成T,与原本具有甲基化修饰的 C 碱基区分开来,再结合高通量测序技术,与参考序列比对,即可判断 CpG/CHG/CHH 位点是否发生甲基化,特别适用于绘制单碱基分辨率的全基因组 DNA 甲基化图谱,准确率高。缺点是DNA可能存在不同程度的降解,检测灵敏度可能会降低,且检测成本较高[13]。

2.2.3 安全测序系统(safe-sequencing system, Safe-SeqS)

Safe-SeqS是一种改进的NGS技术,为每个模板分子分配一个唯一标识符(unique molecular identifier, UMI),可以显著提高灵敏度和准确率。这种方法的特异度目前受到PCR步骤中使用的聚合酶保真度的限制[14]。

2.2.4 标记-复制子深度测序(tagged-amplicon deep sequencing, TAm-Seq )

TAm-Seq的基本原理是设计特异性引物对目标区域进行循环预扩增,产生200 bp以下末端重叠覆盖整个区域的扩增子(预扩增),接着通过单重PCR选择性扩增带突变的扩增子区(标签扩增),从而排除非特异性产物,最后在回收的产物上加接头和特异性条形码,进一步通过单端测序得到最终结果。该检测技术的主要特点是测序通量高,可以同时对数百万个DNA分子进行测序,可检测未知突变,测序时间和成本显著降低,检测灵敏度和特异度达到97%左右[15]。

2.2.5 癌症个体化深度测序 (cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)

CAPP-Seq技术是先在肿瘤基因突变数据库中寻找重复出现的突变相关的外显子,再从肿瘤基因图谱库患者全基因组测序结果中筛选突变,设计探针,靶向富集含常见突变基因中的外显子和内含子,有效地把测序区段浓缩到整个基因组大小的0.004%,使得后续超高深度测序得以实现。其对ctDNA 检测灵敏度达到85%,特异度达到96%[16]。

3 在消化系统肿瘤中的应用

消化系统肿瘤是多种基因突变的结果,对人类的健康产生深远的影响。因此,对于消化系统肿瘤早期癌症的筛查和诊断尤其重要。ctDNA检测具有显著优势,通过比较CTC、miRNA等常见液体活检检测方式,ctDNA具有较好的灵敏度和特异度,且优于传统的肿瘤标志物[17-18],如结直肠癌的传统肿瘤标志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)。利用ctDNA检测对消化系统肿瘤进行早期筛查诊断、治疗方案制定、疗效检测、术后残余病灶及预防疾病复发/预后分析将为消化系统肿瘤患者带来福音。目前,国内外已批准多项ctDNA检测相关试剂盒[19-20],详见表1和表2。

表1 FDA批准的结直肠癌早筛诊断相关ctDNA检测试剂盒[19]Tab.1 FDA-approved ctDNA test kits for early screening diagnosis of colorectal cancer[19]

表2 国家药品监督管理局官网检索的获批ctDNA甲基化试剂盒[20]Tab. 2 National Medical Products Administration (NMPA)-approved ctDNA methylation test kits[20]

3.1 消化系统早期癌症的筛查和诊断

表观遗传改变通常在肿瘤发生过程的早期出现,包括DNA甲基化、组蛋白修饰。Lofton-Day等[21]的研究显示,SEPT9基因甲基化与结直肠癌相关,ctDNA甲基化在结直肠癌的早期诊断中起到重要作用,其灵敏度为95.6%,特异度为99.0%。Iyer等[22]的研究显示,甲基化也适用于肝癌的早期诊断,通过分析肝细胞癌患者血浆和对应肿瘤组织的APC、E-cadherin、FHIT等抑癌基因,发现两者具有一致性。此外,在发现肿瘤相关突变后,通过检测ctDNA的CpG甲基化可实现对癌变组织的定位。

3.2 指导治疗

精准医疗的核心是制定个体化治疗方案,ctDNA蕴含的基因突变信息可方便肿瘤个体化治疗靶点的选择,Gao等[23]的研究显示肿瘤组织中的HER2扩增与ctDNA中的HER2扩增具有高度一致性。同时在结直肠癌组织中的KRAS突变与ctDNA中的KRAS突变状态也保持高度一致,均表明ctDNA的评估可成为消化系统肿瘤如胃癌中HER2的潜在替代指标,ctDNA的相关肿瘤突变信息可指导后续相关位点的靶向用药。Clifton等[24]对未接受抗肿瘤治疗的结直肠癌患者的外周血进行ctDNA检测,发现在4 290例患者中,其中41例患者检测出45种特异的基因融合,其中包括RET基因融合、FGFR3基因融合、ALK基因融合、NTRK1基因融合、ROS1基因融合和FGFR2基因融合等。在出现基因融合的患者中出现基因组的改变则更常见,通过ctDNA检测发现特殊基因融合为治疗方式提供了新的思路。

CRICKET试验[25]评估了对一线西妥昔单抗有反应的患者在治疗中断后重新引入西妥昔单抗的益处。ctDNA样本的回顾性分析[26]数据显示,持续存在RAS突变的患者(即在再治疗前ctDNA中存在RAS突变)不能从重新引入西妥昔单抗中获益。其他正在进行的临床试验,如CHRONOS (NCT03227926)和FIRE-4 (NCT02934529),评估了利用ctDNA指导抗EGFR抗体的再次引入治疗。在一项II期试验中,研究Sym004[包括两种抗EGFR抗体,伏妥昔单抗(futuximab)和扎妥昔单抗(modotuximab),二者针对EGFR的不同表位]在使用西妥昔单抗或帕尼单抗治疗疾病进展的转移性结肠癌(colorectal cancer, CRC)患者中的疗效,ctDNA生物标志物分析显示,部分患者(野生型RAS、BRAF和EGFR ECDs)受益于Sym004[27]。ctDNA能够识别大多数接受HER2靶向治疗的ERBB2扩增转移性CRC患者中可能与耐药性相关的改变。对接受BRAF和EGFR抑制剂联合治疗的BRAFV600E突变的转移性结直肠癌患者样本进行的一系列基于ctDNA的分析显示,在对这些疗法产生耐药性时,MAPK信号通路的组分会出现多种改变。提示MAPK信号的再激活是一种重要的获得性耐药机制,并可在ctDNA中追踪[28]。

3.3 监测治疗效果

ctDNA具有可重复性取样的优势,因此可在病程中多次评估治疗疗效,可通过ctDNA检测实时监测治疗效果,通过ctDNA的基础水平及变化趋势可评价患者对所选择治疗药物的反应。Kim等[29]的一项前瞻性II期临床试验显示,61例接受帕博利珠单抗治疗的晚期胃癌患者的ctDNA下降水平与预后相关。ctDNA的基因组不稳定性可预测化学药物治疗(以下简称化疗)和免疫治疗在多种消化系统肿瘤中的疗效,Xu等[30]发现在晚期胃癌患者中可通过ctDNA基因组不稳定性预测和监测胃癌的治疗反应。

3.4 分析术后残余病灶、预防疾病的复发及预后

ctDNA半衰期短,约15 min～2 h即被降解,因此可实时监测肿瘤治疗过程中肿瘤的负荷变化,相较于传统的肿瘤标志物及影像学,可更早检测出肿瘤残余病灶及预防复发。对于消化系统肿瘤,如胃癌,在行根治术后,仍有部分患者会出现局部复发或部分转移。ctDNA水平与肿瘤负荷及分期均相关,通过检测已知的ctDNA中特定基因位点、拷贝数水平和异常甲基化,可评价微小残留病灶(minimal residual disease, MRD),从而起到预后评估和监测复发的作用,Reinert 等[31]研究发现,在结直肠癌患者中采用ctDNA监测可早于影像学检查平均10个月发现复发。Li等[32]通过ctDNA检测发现TP53和MET基因扩增可预测胃癌患者的不良预后。Lecomte等[33]发现在结直肠癌患者中CDKN2A启动子超甲基化及KRAS突变可作为独立的预后因素。

4 局限性

4.1 目前不同ctDNA的检测方法各有优缺点

目前ctDNA的检测方法主要分为以PCR为基础的技术和以NGS为基础的技术。以PCR为基础的几种技术虽然准确率高,成本低,但是通量低,不能检测未知突变,未来发展能力有限。以NGS为基础的技术检测成本较高。其中对于ctDNA甲基化的检测,传统的甲基化检测技术,对于痕量DNA难以实现高精准度、高灵敏度及绝对定量的检测,后续可采用更先进的技术,如DNA微阵列芯片发现潜在的肿瘤甲基化标志物。

4.2 ctDNA检测缺乏统一标准

ctDNA在消化系统肿瘤的早期筛查、动态监测中得到广泛应用,但ctDNA在外周血中的丰度较低,难以提取和分析,且易受到cfDNA、基因组DNA影响,各个检测平台的灵敏度和特异度均有所不同,目前暂缺乏统一的标准,不同实验室对于ctDNA的检测结果的可比性较差,亟需统一的判断标准、制定统一的行业规则以保证结果的可靠性、重复性及准确性。

4.3 对血液样本保存的要求较高

血液样本保存不当容易干扰结果判定,采血后若处理不及时则外周血细胞释放的核酸会影响ctDNA的测定。各阶段的处理,包括采血至分离血浆的时间间隔、离心和纯化方案、储存温度等均会影响最终的测定结果。

5 结论与展望

基于ctDNA作为生物标志物应用于消化系统肿瘤的早期筛查、指导治疗、监测治疗效果及判断预后具有巨大的潜力,ctDNA广泛应用于临床是必然趋势,但仍需要大规模、多中心的临床研究来进一步验证其应用于不同消化系统肿瘤的有效性、敏感性。

ctDNA将会推动个体化治疗及精准治疗的进展[34],通过ctDNA检测肿瘤特异性基因特征和表观遗传学特征的变化,并应用于筛查、诊断、治疗及判断预后中,个体化的医疗方式将会为患者选择最合适的治疗方案,ctDNA的个体化的医疗方式将为肿瘤领域带来崭新的格局。

在未来,WGS检测成本的下降将为ctDNA检测提供更有吸引力的替代方案,取代需要单独验证和标准化程序的独立癌症诊断测试。从30～35倍的中等测序覆盖率,将能够从单个数据集中获得cfDNA信息,包括从个性化突变跟踪到组织反卷积的分析可能性。然而,由于甲基化标记是目前主要的组织特异性标识符,可能WGBS为组织反卷积提供了WGS的替代方案。从不同的WGS分析中获得的复杂数据阵列将代表多维数据,以进行特征提取和各种机器学习[35]。最终,有可能开发出一种能够区分来自健康个体血液的cfDNA和来自癌症患者血液的cfDNA的模型。适当的模型建立有利于精细化的肿瘤分类/分型,评估肿瘤发展和识别药物靶点或耐药标记,这也将为ctDNA检测开辟令人兴奋的途径。

此外,近期报道的DNA片段的早期评估新方法——早期拦截片段的DNA评估 (DNA evaluation of fragments for early interception,DELFI)可通过对cfDNA片段模式的全基因组评估来识别cfDNA中的大量异常。DELFI可能有助于识别肿瘤来源的ctDNA,通过将DELFI与cfDNA序列改变的检测相结合,可显著提高检测的灵敏度[36]。ctDNA检测技术的进步也将为其在消化系统肿瘤的诊断治疗方面提供更多助力。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明于明鑫:提出选题思路,查阅文献,论文撰写及修订;杨爱明:提出修订意见,审校论文。