高效液相色谱法测定黄芩中12种黄酮类成分的含量

李轲，田玉洁，田雨晴，李美嬉，郝敬虹，杨柳

（农业应用新技术北京市重点实验室/植物生产国家级实验教学示范中心/北京农学院，北京 102206）

0 引言

黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)是唇形科黄芩属多年生草本植物[1]。黄芩地上部分和地下部分的成分相似，即都含有丰富的黄酮类物质，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和清热解毒的生物活性和药理活性[2-4]。黄芩根作为传统中药使用，性寒[5]，味苦[6]，有清热燥湿[7]、泻火清心[8]等功效。黄芩茎叶具有解热镇痛、抗炎抗病毒等作用[9]。近年来，为扩大利用资源，增加黄芩的附加值，对黄芩的地上、地下部分的化学成分和药理作用研究日益增多[10-11]。

近年来，黄酮化合物在医药[12]、食品[13]、化妆品[14]等方面应用广泛，黄酮类化合物含量的研究方兴未艾。靳维荣[15]采用HPLC法（高效液相色谱法）同时测定黄芩中6种黄酮类成分（野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、芹菜素、汉黄芩素和白杨素）的含量。魏亚枫等[16]采用HPLC 法（高效液相色谱法）测定黄芩与黄芩茶中的5种黄酮类成分（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A）的含量。黄芩整株都有利用价值，现有研究对黄芩根较深入[17-18]，忽视了对黄芩茎叶的研究，尤其是黄芩根部与茎叶部位黄酮含量的差异未见报道。为了探究黄芩不同部位黄酮含量，本试验采用HPLC法（高效液相色谱法）同时测定黄芩中12种黄酮成分，耗时短，可测定黄芩不同生长部位以及整个生长期的12 种黄酮含量。《中国药典》[5]中规定利用高效液相色谱法测定黄芩含量，且只测定了黄芩苷，要求结果中含黄芩苷不得少于9%，本研究方法测定黄芩茎叶、黄芩根中黄芩苷含量均高于9%，测得数据在《中国药典》通则0512“高效液相色谱法”中规定允许变动的条件范围内进行。

本研究采用HPLC法（高效液相色谱法）测定黄芩苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、红花素等12种黄酮类化合物的含量，为黄酮类物质检测提供一种更加简便、快捷的检测方法，同时为黄芩资源开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1200 型液相色谱仪（包括四元溶剂泵、脱气机、自动进样器、柱温箱、光电二级管阵列检测器及软件），超声波发生器（深圳市欧泊创新设备有限公司），高速多功能粉碎机（武义鼎藏日用金属制品厂），万分之一天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

图1 标准品与样品色谱图

1.2 药品和试剂

标准品：野黄芩苷（批号：Y01201905020）、黄芩苷（ 批号：H00811206032）、木犀草素（ 批号：M00702004028）、汉黄芩苷（批号：H01911809030）、芹菜素（ 批号：Q00211801029）、黄芩素（ 批号：H01411203026）、汉黄芩素（批号：H02004007026）标准品购自北京盛世康普化工科技研究所院；千层纸素A（批号：Q02011809028）、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（批号：S54787）、白杨素（批号：S00408）、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷（批号：S69457）标准品购自北京谱析科技有限公司；红花素（批号：211006）标准品购自上海融禾医药科技发展有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯级（Fisher scientific公司），磷酸为分析纯级（上海麦克林生化科技有限公司），水为娃哈哈纯净水（上海娃哈哈饮用水有限公司），黄芩茎叶，黄芩根。试验所用的黄芩采自房山区蒲洼乡，经北京农学院徐践老师验证，鉴定均为唇形科植物黄芩S.baicalensis Georgi.的干燥茎叶和根。

1.3 HPLC法测定

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测波长：280 nm；进样量：10 μL；流动相：乙腈(A)，0.1%磷酸水(B)，梯度洗脱见表1。在上述色谱条件下进样测定，结果显示，各峰分离情况良好。色谱见图1。

表1 梯度洗脱条件

1.4 标准品溶液的制备

分别称取标准品野黄芩苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、红花素、黄芩苷、木犀草素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A 5 mg（精确到小数点后4 位），置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得标准品储备液，4℃冷藏，备用。

1.5 混合标准品溶液的制备

取野黄芩苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、红花素、黄芩苷、木犀草素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A 标准品储备液适量，用甲醇配制成质量浓度50、50、60、20、20、20、10、12.5、70、15、35、100 μg/mL 的混合标准品溶液。

1.6 样品溶液的制备

以黄芩茎叶为例，将黄芩样品切段，用高速多功能粉碎机粉碎，过60 目筛得黄芩样品粉末，称取黄芩茎叶粉末1 g（精确到小数点后4 位），置于250 mL 锥形瓶中，加入适量70%甲醇（第1次提取加20 mL 70%甲醇，第2 次第3 次提取加10 mL 70%甲醇），超声提取3次，每次40 min。定容至50 mL 容量瓶中，摇匀，用0.45 μm 针头过滤器过滤即得样品溶液。如测定样品为黄芩根部，应称取黄芩根粉末0.5 g（精确到小数点后4位），其他步骤不变。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

取混合标准品溶液，按“2.1”项色谱条件进行分析。以标准品进样量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，制作标准曲线，得12种成分的回归方程，结果表明各成分在相应进样量范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。线性关系考察结果见表2。

表2 线性关系考察结果

2.2 精密度试验

称取黄芩根粉末0.5 g（精确到小数点后4 位），按“2.4”方法制备样品溶液，按“2.1”色谱条件进行检测，连续进样3次，结果见表3，野黄芩苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、红花素、黄芩苷、木犀草素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A 峰面积的RSD分别为0.07%、4.41%、1.11%、1.95%、0.30%、0.28%、0.37%、0.12%、0.27%、0.30%、0.30%、0.91%，表明该方法精密度良好。

表3 精密度考察结果(n=3)

2.3 重复性试验

称取黄芩根粉末0.5 g（精确到小数点后4 位），按“2.4”方法制备3份样品溶液，按“2.1”色谱条件进行检测，结果见表4，野黄芩苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、红花素、黄芩苷、木犀草素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A 峰面积的RSD分别为0.26%、1.70%、1.92%、1.61%、0.20%、0.46%、0.38%、4.01%、1.34%、1.38%、1.30%、2.16%，表明方法重复性良好。

表4 重复性考察结果(n=3)

2.4 稳定性试验

称取黄芩根粉末0.5 g（精确到小数点后4 位），按“2.4”方法制备样品溶液，按“2.1”色谱条件进行检测，放置不同时间后进行进样，分别在第0、6、12、24、48 h后间隔进样，考察溶液稳定性。结果见表5，野黄芩苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、红花素、黄芩苷、木犀草素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A 峰面积的RSD分别为0.43%、4.45%、1.11%、2.11%、0.59%、0.41%、0.46%、4.21%、0.55%、0.31%、1.55%、0.99%，表明样品溶液48 h内稳定性较好。

表5 稳定性考察结果(n=5)

2.5 加样回收率试验

称取已知含量的黄芩茎叶粉末1 g（精确到小数点后4位）和黄芩根粉末0.5 g（精确到小数点后4位），各平行操作3份，置于锥形瓶中，分别加入各标准品溶液适量，按“2.4”方法制备的样品溶液，并按“2.1”色谱条件进行检测，各进样10 μL，计算其回收率，结果见表6。

表6 加样回收率试验结果(n=3)

2.6 样品含量测定

分别称取黄芩茎叶粉末1 g（精确到小数点后4位）和黄芩根粉末0.5 g（精确到小数点后4 位），按“2.4”方法制备样品溶液，按“2.1”色谱条件进行检测，用外标法计算各成分的含量，结果见表7。

表7 平均样品含量(n=3)

3 讨论与结论

现有研究对黄芩根较深入，忽视了对黄芩茎叶的研究，尤其是黄芩根部与茎叶部位黄酮含量的差异未见报道。采用HPLC 法，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测波长为280 nm；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，建立一种测定黄芩中十二种黄酮类成分含量的测定方法。

在整株黄芩中，黄芩根的黄酮成分主要为黄芩苷和黄芩素[19-20]，茎叶中除野黄芩苷和黄芩苷外还有黄芩素、野黄芩素、白杨素、木犀草素、芹菜素等多种黄酮成分[21-22]，茎叶与根成分的种类与含量存在明显差异，现有研究对黄芩根比较深入，忽视了对黄芩茎叶的研究。为了达到测定需求，选择黄芩苷、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、芹菜素、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、白杨素、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、红花素等12 种黄酮类成分，用一种方法同时测定黄芩中十二种黄酮类成分的含量，体现出黄芩不同部位黄酮物质的分布情况。由表7 可以得出，黄芩根中的十二种黄酮总量为106.5819 mg/g，2020 年春季黄芩茎叶的黄酮总量为107.3057 mg/g，2020 年秋季黄芩茎叶的黄酮总量为37.8509 mg/g，可以看出不同时期，不同部位的黄芩中12种黄酮类成分含量都可用此方法测定。

本试验以黄芩中黄酮类物质多组分分离为目的，在同一色谱条件下分离多种成分。通过对甲醇、乙腈与不同浓度磷酸溶液的流动相体系进行考察，结果表明，甲醇-磷酸溶液系统中红花素与芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色谱峰无法分离，汉黄芩素、白杨素与千层纸素A的色谱峰无法分离，乙腈-磷酸溶液系统作为流动相对黄芩各成分的分离度较好，通过试验，确定乙腈-0.1%磷酸溶液体系可达到同时测定黄芩根、茎叶中黄酮含量的检测要求。本方法分离效果好、操作简便、重复性好、灵敏度高，检测方法可行。目前正在探索黄芩中更多黄酮类物质，应用所建立的方法测定不同生长部位、不同生长期黄芩中的黄酮成分和含量，为黄芩资源的使用提供效率。

本试验建立的12种黄酮成分含量的方法，测定黄芩中12 种黄酮类物质在质量浓度范围内线性关系良好(r＞0.98)，平均加样回收率分别为99.7214%、92.7039%、103.9755%、100.5837%、92.4819%、93.2465%、99.6387%、104.3866%、95.0767%、95.3245%、92.2161%、95.3995%(RSD＜5)。线性关系、精密度、重复性、稳定性均满足分析要求，适用于黄芩根部及茎叶中12种黄酮类成分的检测。