硫酸-蒽酮分光光度法测定灵芝功能食品中粗多糖含量*

戴志英，郭新颖，叶青华

（江苏省南通市疾病预防控制中心，江苏南通 226007）

灵芝中粗多糖是灵芝的有效成分之一，粗多糖是一种复合型杂多糖，有脂多糖、黏多糖、糖蛋白等，粗多糖的保健作用非常多，不仅可以提高人体内生理细胞活性，增强免疫功能，而且具有降血糖、降血脂和抗癌功效，因此，灵芝功能食品成为倍受人们喜爱的药食同源保健品。目前，国内外对灵芝多糖的研究比较多，所以，本文研究了硫酸-蒽酮法测定灵芝功能食品中粗多糖含量的条件，并进行方法学验证，同时对抽取的市场上5 种不同灵芝功能食品进行了粗多糖含量的测定，为人们提供消费依据。

1 实验部分

1.1 实验原理

多糖经沸水浴提取后，用乙醇沉淀分离，除去可溶性杂质干扰，沉淀用纯水溶解后，加入硫酸-蒽酮溶液，多糖与H2SO4在沸水浴中加热脱水生成轻甲基呋喃甲醛，再以蒽酮缩合成蓝绿化合物，该物质在625nm 处有最大吸收，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与溶液中糖的浓度呈正比。

1.2 试剂与仪器

无水乙醇、葡萄糖、蒽酮，分析纯；H2SO4，优级纯；以上试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

N15GB167839 香菇质控样品（指定值（1.00±0.05）g/100g 上海源叶生物科技有限公司）。WFJ7200型分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）；PRl-MOR 离心机（赛默飞一世尔科技公司）；50mL 塑料离心管。

1.3 溶液的配制

1.3.1 0.1%的硫酸-蒽酮溶液 称取0.05g 蒽酮置于50mL 容量瓶中，缓慢加入50mL H2SO4溶液（取浓H2SO438mL，缓慢加到12mL 纯水中），摇匀，现用现配。

1.3.2 1000μg·mL-1葡萄糖标准溶液 准确称取1.0000g 已干燥恒重的葡萄糖，加水溶解后用纯水稀释至1000mL，混匀。

1.3.3 100μg·mL-1葡萄糖使用液 用移液管吸取10mL 1000μg·mL-1的葡萄糖标准溶液于100mL 容量瓶中，加纯水至刻度，混匀。

1.4 实验方法

1.4.1 标准曲线的制备 准确吸取100μg·mL-1葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于10mL具塞比色管中，相当于含0、10、20、40、60、80、100μg葡萄糖，加水至1.0mL，在冰浴中向各管加入5mL 硫酸-蒽酮溶液，充分混匀，在沸水浴中加热10min，取出在流水中冷却20min 后，在波长为625nm 下用1cm比色皿试剂空白调零，测定吸光度，绘制标准曲线。

1.4.2 样品处理 称取0.50～1.00g 已粉碎均匀的样品，置于50mL 塑料离心管中，加水约40mL，沸水浴中煮沸2h，取出冷却，以8000r·min-1离心5min，收集上清液，残渣加水约10mL 后置于沸水浴中煮沸2h，以8000r·min-1离心5min，合并2 次上清液，加水至100mL，混匀后取溶液5～10mL 加无水乙醇40mL，摇匀，冷藏放置过夜，然后以8000r·min-1离心5min，将沉淀用水溶解至100mL，混匀后供测定。

1.4.3 样品测定 吸取样品待测液1mL 于10mL 具塞比色管中，以下操作按1.4.1 标准系列同法操作，测定吸光度，计算样品中粗多糖含量。

1.4.4 计算公式

式中X：试样中粗多糖含量（以葡萄糖计），g/100g；m2：1mL 样品待测液的吸光度值相当含粗多糖质量，μg；m1：取样量，g；v1：样品经沸水浴提取定容后的取样体积，mL；100：第一个100 是样品经沸水浴2 次提取后，上清液合并后的定容体积，mL；100：第二个100是加入无水乙醇后的沉淀用纯水定容的体积，mL；1：吸取待测样品液的体积，mL。

2 结果与讨论

2.1 最佳吸收波长的选择

按1.4 项实验方法，吸取100μg·mL-1葡萄糖标准溶液1.00mL 于10mL 具塞比色管中，于冰浴中加入5mL 硫酸-蒽酮溶液，混匀，于沸水浴中煮沸10min，取出在流水中冷却20min 后，在580～660nm处进行吸光度测定，结果表明，溶液在625nm 处有最大吸收，故选择625nm 为测定波长。

2.2 水浴反应时间的确定

在冰浴中配制浓度为100μg/6mL 的葡萄糖标准溶液6 管，涡旋均匀后立即于沸水浴中加热，反应时间分别为2、4、6、8、10、12min，在流水中冷却至室温后，于625nm 处测其吸光度，结果见表1。

表1 不同反应时间对应的吸光度值Tab.1 Absorbance values corresponding to different reaction times

由表1 可见，吸光度随沸水浴时间的增加而逐渐增加，当沸水浴反应时间达到10min 后，吸光度趋于稳定，故沸水浴反应时间确定为10min。

2.3 线性范围及检出限

葡萄糖含量在0～100μg/6mL 范围内，符合比耳定律，回归方程Y=0.005198X+0.01190，相关系数r=0.9990。测定11 个样品空白液的吸光度，计算其标准偏差，方法的检出限为0.333μg·mL-1。

2.4 精密度实验

配制10μg/6mL、40μg/6mL、100μg/6mL 的低、中、高3 种葡萄糖标准溶液，按实验方法1.4.3 测定浓度，计算其相对标准偏差，结果见表2。

由表2 可见，相对标准偏差为1.02%～4.99%，可以满足分析检测的要求。

2.5 方法的准确度

采用标准物质法，分别称取2.0g 标准物质6 份，按1.4.2 方法同法处理，按1.4.3 方法测定吸光度，计算多糖含量，测得的多糖含量为0.98g/100g，标准物质的指定值为（1.00±0.05）g/100g，可见方法具有较好的准确性。

2.6 样品测定

本文对市场管理局抽采的5 个灵芝功能食品按实验方法测定粗多糖含量，称取0.50～1.00g 已粉碎均匀的样品，同时加入1000μg·mL-1葡萄糖标准溶液20mL（含20000μg 葡萄糖）进行加标回收实验，结果见表3。

表3 样品测定及回收率实验结果（n=6）Tab.3 Sample determination and recovery test results（n=6）

由表3 可见，加标回收率为90.0%～92.5%，结果良好，符合检测要求。

3 结论

本文用沸水浴浸提多糖，再根据粗多糖不溶于乙醇的特性，在提取液中加乙醇将多糖变成沉淀，然后用纯水将沉淀溶解，加入硫酸-蒽酮溶液形成蓝绿色化合物比色计算粗多糖，该方法精密度和准确度均能满足食品分析要求，检测结果可靠。