大熊猫主食竹竹叶提取物对冷应激小鼠免疫功能的作用效应研究

陈建秋,方婷婷,彭 西,王 乐,唐春芳,袁施彬

(1.西华师范大学 生命科学学院,四川 南充 637009;2.成都大学 药学院,成都 610106)

冷应激是指当外界环境温度低于动物的最适生存温度时,动物机体为了维持内环境的稳态,所作出的非特异性应答反应的总和[1]。当动物遭受冷应激时,会出现一系列诸如激素水平、能量代谢和免疫水平变化等应激反应。野生大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)的生活环境温度在-10～25 ℃[2],且习惯生活在10 ℃左右的环境中[3]。研究发现,陕西佛坪国家级自然保护区的大熊猫从当年9 月到次年4 月,几乎都在巴山木竹(Bashaniafargesii)林中(冬居地)活动,巴山木竹叶在其食物组成中的比例高达98.3%[4]。而该地区冬季平均温度为-3 ℃[5],最低可降至-12.9 ℃。由此推测,该地区大熊猫冬季可能遭受着环境的冷应激。

植物提取物富含黄酮类、生物碱、多糖、皂苷、多酚和挥发油类等活性成分,具有抗氧化、抗菌、增强免疫力和改善动物肠道健康等生物学功能[6]。大量研究发现,许多植物提取物都具有一定的抗冷应激作用[7]。对于以竹为生的大熊猫,竹类既是食物,也是药物。本课题组前期研究发现,陕西佛坪大熊猫可食竹中含具特殊药效的植物次生代谢产物(Plant Secondary Metabolites,PSMs),其中黄酮类化合物具有提高动物免疫功能的作用[8],在大熊猫活动区域和它对竹的喜食部位中含量更为丰富[9]。栗明月等[10]研究发现,不同浓度的竹叶提取物(Bamboo Leaf Extract,BLE)能显著提升常温状态下奶牛血液淋巴细胞(Lymphocytes,Lymph)数量、粒细胞(Granulocytes,Gran)数量和免疫球蛋白含量。同时,饲粮添加1.3 g·kg-1的BLE能显著提高热应激奶牛的免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)含量[11],改善了机体免疫功能。但大熊猫摄食竹中的PSMs是否具有提高冷应激条件下动物的免疫功能,抵抗内源性和外源性疾病因子的侵袭,目前尚无相关报道。因此,本研究以小鼠为研究对象,通过给慢性冷应激小鼠灌胃巴山木竹BLE,探究BLE对冷应激小鼠免疫功能的作用效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和实验设计

选取体重为20 g±2 g的7周龄雌性SPF级昆明小鼠240只(重庆腾鑫生物技术有限公司提供),按照2×2因子实验设计分为常温对照组、常温BLE组、低温对照组和低温BLE组,每组5 个重复,每个重复12 只鼠。预饲1周。实验期间,各处理组小鼠于每日早上08∶00进行称重和灌胃,BLE组小鼠每天灌胃每克体重0.34 mg的BLE,对照组小鼠灌胃每克体重0.34 mg的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。小鼠均饲养于25 ℃环境中,低温处理组小鼠每天于09∶00—13∶00移至4 ℃环境中处理4 h,实验持续28 d,所有小鼠实验期间自由采食与饮水。在实验第14 d和第28 d,分别从每组中随机选择30只(共120只)小鼠进行采血和取样。巴山木竹BLE的制备和BLE混悬液的配制具体方法参照文献[9],BLE灌胃剂量参考课题组前期研究结果[12]。

1.1.2 主要仪器与试剂

仪器:CX22光学显微镜(日本OLMPUS公司);DM1000徕卡显微成像系统(德国Leica公司);RM2235石蜡切片机(德国Leica公司);KD-98-Ⅱ A恒温水浴锅(中国天津市泰斯特仪器有限公司);HC-BC-2800Vet血细胞分析仪(中国Mindray公司);Epoch酶标仪(中国广州仪器科学仪器有限公司);CytoFLEX流式细胞仪(美国Backman Coulter公司)。

试剂:苏木素(美国Thermo Fisher公司);伊红(美国Thermo Fisher公司);ELISA试剂盒(中国联科生物);乙酸乙酯、多聚甲醛、无水乙醇和二甲苯等(中国成都市科隆化学品有限公司);Rat Anti-Mouse CD19-APC、Hamster Anti-Mouse CD3ε-FITC、Rat Anti-Mouse CD4-PE/CY5.5和Rat Anti-Mouse CD8α-PE/CY7(美国Southern Biothech公司)。

1.2 方法

1.2.1 脾脏组织病理学观察

摘眼球法处死小鼠,取脾脏,用4 %多聚甲醛固定,固定时间大于24 h,按照常规切片制作方法进行脾脏组织样品的脱水、切片、HE染色后显微镜下观察脾脏组织病理学变化,并拍照记录病变部位组织损伤。

1.2.2 血常规指标检测

配制EDTA-K2抗凝剂,摘眼球取血液于对应抗凝管中,用HC-BC-2800Vet血细胞分析仪检测血液Lymph、单核细胞(Monocytes,Mon)和Gran含量。

1.2.3 血清免疫蛋白含量检测

摘眼球法取血,室温静置30 min,4 000 r·min-1离心10 min,制备血清。采用ELISA试剂盒检测血清IgA、免疫球蛋白IgG(Immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)含量。

1.2.4 小鼠外周血T淋巴细胞亚群含量检测

取100 μL外周血,分别加入Rat Anti-Mouse CD19-APC、Hamster Anti-Mouse CD3ε-FITC、Rat Anti-Mouse CD4-PE/CY5.5和Rat Anti-Mouse CD8α-PE/CY7流式抗体1 μg,混匀后4 ℃避光染色30 min。加入1 mL 1 X红细胞裂解液,室温孵育10 min,加入1 mL 4 ℃ PBS液混匀,250 g离心5 min,弃上清后加入2 mL PBS液洗涤1次,再加入400 μL PBS液,混匀后用CytoFLEX流式细胞仪检测,采用Kaluza 2.1软件对数据进行分析。

1.2.5 小鼠脾脏细胞凋亡率检测

机械法剪碎脾脏组织,过滤,250g离心5 min,用PBS调节细胞浓度为106个·mL-1,取100 μL细胞悬液,250g离心5 min,弃去上清液后加入200 μL现配1 X结合缓冲液重悬细胞。先加入Annexin V-FITC染色荧光染料5 μL,室温避光处理10 min;再加入PI染色剂10 μL,室温避光染色5 min;最后加入结合缓冲液400 μL,混匀后用CytoFLEX流式细胞仪检测,采用Kaluza 2.1软件对数据进行分析。细胞凋亡率=凋亡细胞总数/细胞总数×100%。

1.2.6 小鼠脾脏T淋巴细胞亚群含量检测

机械法剪碎脾脏组织,过滤,250g离心5 min,用PBS调节细胞浓度为106个·mL-1,取100 μL细胞悬液,分别加入Hamster Anti-Mouse CD3ε-FITC、Rat Anti-Mouse CD4-PE/CY5.5和Rat Anti-Mouse CD8α-PE/CY7流式抗体1 μg,混匀后4 ℃避光染色30 min。加入2 mL的PBS液洗涤1次,加入400 μL的PBS液重悬细胞后用CytoFLEX流式细胞仪检测,采用Kaluza 2.1软件对数据进行分析。

1.3 数据处理与分析

所有数据使用Excel 2016进行整理,并用SPSS 22.0进行数据统计分析,结果以平均数±标准误表示,数据若符合正态分布,采用独立样本T检验分析组间差异,反之,采用Kruskal-Wallis检验。P<0.05表示差异显著,P< 0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 脾脏病理组织学观察

实验第14 d,常温对照组和常温BLE组小鼠脾脏组织结构正常,未见明显病理学改变(图1a、b),低温对照组和低温BLE组脾窦扩张轻度淤血,脾小体内细胞空洞增多,空腔增大,空洞内核碎片较多(图1c—f)。实验第28 d,常温对照组、常温BLE组、低温BLE组小鼠脾脏均未见明显的病理学改变(图2a、b、d),低温对照组脾小体内细胞见较多空洞,空洞内核碎片较多(图2c)。

2.2 血常规指标检测结果

灌胃BLE对冷应激小鼠Gran、Mon和Lymph的影响见图3。低温和灌胃均对小鼠Gran、Mon和Lymph含量无显著影响(P>0.05)。在实验第14 d,与低温对照组相比,低温BLE组Gran(图3a)、Mon(图3b)和Lymph(图3c)分别提升5.3 %、13.7 %和12.8 %;在实验第28 d,与低温对照组相比,低温BLE组Gran(图3a)、Mon(图3b)和Lymph(图3c)分别提升8.7%、22.0%和6.2%。

2.3 血清免疫球蛋白含量检测结果

灌胃BLE对冷应激小鼠血清IgA、IgG和IgM的影响见图4。在实验第14 d,与常温对照组相比,常温BLE组和低温对照组IgG(图4b)含量均极显著升高(P<0.01),低温对照组IgM(图4c)含量显著升高(P<0.05);与低温对照组相比,低温BLE组IgG(图4b)和IgM(图4c)含量均极显著降低(P<0.01);在实验第28 d,与常温对照组相比,常温BLE组IgA显著降低(P<0.05,图4a),低温对照组IgA含量极显著降低(P<0.01,图4a);与低温对照组相比,低温BLE组IgA含量极显著降低(P<0.01,图4a);与实验第14 d相比,在实验的第28 d,低温对照组IgG含量极显著降低(P<0.01,图4b),低温对照组IgM含量显著降低(P<0.05,图4c)。

2.4 外周血T淋巴细胞亚群检测结果

灌胃BLE对冷应激小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和CD4+/CD8+的影响见图5。在实验第14 d,各处理组外周血CD3+(图5a)、CD4+(图5b)、CD8+(图5c)和CD19+(图5d)含量均无显著差异(P>0.05)。在实验第28 d,与常温对照组相比,常温BLE组CD19+含量极显著升高(P<0.01,图5d);与低温对照组相比,低温BLE组CD19+含量极显著升高(P<0.01,图5d)。与实验第14 d相比,在实验的第28 d,常温BLE组CD8+极显著降低(P<0.01,图5c),而CD19+含量极显著升高(P<0.01,图5d);低温BLE组CD19+含量和CD4+/CD8+值均极显著升高(P<0.01,图5d和5e)。

2.5 脾脏细胞凋亡率检测结果

不同处理对小鼠脾脏细胞凋亡率的影响见图6。在实验的第14 d,与常温对照组相比,常温BLE组脾脏细胞凋亡率极显著降低(P<0.01);与低温对照组相比,低温BLE组凋亡率极显著降低(P<0.01)。与实验第14 d相比,在实验第28 d,常温对照组凋亡率显著降低(P<0.05);低温对照组凋亡率极显著降低(P<0.01)。

2.6 脾脏T淋巴细胞亚群检测结果

不同处理对小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+的影响见图7。在实验的第14 d,与常温对照组相比,低温对照组CD4+含量极显著降低(P<0.01,图7b);与常温BLE组相比,低温BLE组CD4+极显著降低(P<0.01,图7b)。在实验的第28 d,与常温对照组相比,低温对照组CD4+含量极显著降低(P<0.01,图7b),常温BLE组CD8+含量显著降低(P<0.05,图7c);与常温BLE组相比,低温BLE组CD4+含量显著降低(P<0.05,图7b),低温BLE组CD4+/CD8+含量显著降低(P<0.05,图7d)。

3 讨 论

动物在受到冷应激时,机体在神经系统、内分泌系统和免疫系统的协同作用下,发生免疫调节。急性冷应激能够提高小鼠的免疫能力,而慢性冷应激通常会抑制机体的免疫系统[13]。在参与机体免疫应答反应的相关免疫细胞中,淋巴细胞是特异性免疫反应的核心,中性粒细胞是通过吞噬作用清除入侵病原体的第一道防线,单核细胞则是激活淋巴细胞发挥特异性免疫作用的重要组成部分[14]。本研究发现,冷应激小鼠血液中Gran、Mon和Lymph含量不同程度的降低,表明持续的冷应激会抑制小鼠免疫反应。 众所周知,植物提取物作为功能性添加剂已广泛应用于食品和畜禽生产中。竹叶提取物富含黄酮类化合物、生物活性多糖、酚酸类化合物、蒽醌类化合物、萜类内酯、特种氨基酸和活性肽以及锰、锌、硒等微量元素等,可通过食源进入动物机体发挥免疫调节作用进而提高动物机体的免疫功能[15]。本研究发现,低温条件下灌胃BLE 14 d和28 d的小鼠血液Gran、Mon和Lymph含量变化无显著性差异,可能的原因是小鼠免疫能力个体差异大,所以未达到显著效果。但Mon含量较冷应激组分别提高了13.7 %和22.0 %,说明BLE能在一定程度上提高冷应激小鼠的特异性免疫反应。

免疫球蛋白是介导机体体液免疫反应的B细胞分泌产物,可以反映机体的免疫状态[16]。Olfati等[17]研究发现,肉鸡持续饲养在12 ℃的寒冷环境20 d后,血清中IgM和IgG含量显著降低。本研究发现,冷应激处理显著降低血清IgA含量,随着冷应激的时间延长,血清IgM和IgG含量也下降。植物提取物对机体免疫反应的影响主要表现为血液中IgA、IgG和IgM含量的改变[18]。Fan等[19]研究发现,植物提取物能显著提高母鸡血液IgA和IgG含量。本研究发现,常温下灌胃BLE第14 d时小鼠血清IgA和IgG含量均有所提升,说明BLE能在一定程度上调节小鼠的体液免疫。此外,T淋巴细胞可以通过细胞接触依赖机制间接参与免疫应答,介导细胞免疫。王英华等[20]研究发现,大豆异黄酮能提高蛋鸡外周血CD3+、CD4+含量。本研究发现,冷应激处理下小鼠外周血CD3+、CD4+和CD8+含量均降低,灌胃BLE则能提高外周血CD4+和CD19+含量,说明BLE能提高冷应激小鼠的细胞免疫。

脾脏作为动物体内最大的淋巴器官,是机体细胞免疫和体液免疫的中心,也是各种免疫细胞居住、增殖和产生免疫反应及免疫效应物质的基地[21]。持续的冷应激会使小鼠的脾脏组织发生渐进性退化现象[22]。前人研究发现,竹叶提取物可增加脾脏的重量,增强免疫细胞的活性[23]。在本研究中,冷应激小鼠脾脏出现明显组织病理损伤,但灌胃BLE的冷应激小鼠的脾脏结构没有明显的病理变化,表明BLE能够改善冷应激小鼠脾脏组织损伤。脾脏形态结构异常往往是其功能受损的重要外在体现。本研究发现,冷应激处理小鼠脾脏CD3+、CD4+和CD8+含量均降低,灌胃BLE则能提升脾脏CD3+、CD4+含量以及CD4+/CD8+值,表明低温环境可通过降低小鼠脾脏T淋巴细胞总量进而降低小鼠细胞免疫功能,而BLE能从一定程度上缓解低温环境对小鼠免疫功能的损伤。高温或寒冷等多种外界刺激因子均会造成机体免疫抑制进而导致细胞凋亡[24]。细胞凋亡指机体为维持内环境稳定,在多种基因控制下,宿主细胞的程序性死亡,可以受到外源物质的影响而发生改变[25]。祖桂芳等[26]研究发现,BLE能降低细胞凋亡率且效果优于红豆越橘提取物。在本研究中,冷应激处理小鼠脾脏细胞凋亡率显著升高,灌胃BLE则能显著降低小鼠脾脏细胞凋亡率,这说明BLE能够减轻低温刺激给小鼠脾脏带来的细胞凋亡。综上所述,BLE可通过促进冷应激下小鼠免疫细胞的增殖与分化,降低免疫器官的免疫损伤,来提高小鼠机体的细胞免疫和体液免疫,进而提高小鼠的免疫功能。

4 结 语

对特有的保护动物而言,全面了解其主要食物的营养生物学功能有助于确定影响其种群发展的主要因素,优化种群管理策略,实现种群的可持续性发展。本研究发现,大熊猫主食竹巴山木竹BLE可在一定程度上通过提高动物的细胞免疫、体液免疫和降低脾脏细胞凋亡率等来调节动物的免疫功能,抵抗低温环境对动物造成机体重要的免疫器官(如脾脏等)的应激损伤。大熊猫以竹为生,保护区野生大熊猫在冬季尤以竹叶为主食。竹类不仅要满足其生长、发育和繁殖等对营养的需求,还要满足其抵抗内源性和外源性疾病因子侵袭的需求。结合相关探索性研究结果,进一步研究大熊猫主食竹中抗病化合物成分及其体内外作用机制,可深度解析野外大熊猫的精细觅食策略,在一定程度上提高就地保护和迁地保护成效。