牛结核病诊断方法的研究进展

黄雅琳，李盛琼，尹 杰，高 露，杨天俊，邓 兵，阳爱国*，侯 巍*

（ 1. 四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041 ；2. 富顺县农业农村局，四川 自贡 643200 ； 3. 安州区动物疫病预防控制中心，四川 绵阳 622651）

牛结核病是一种无季节流行性、慢性、消耗性的人畜共患病，感染宿主类型较广，约有50多种哺乳动物和25种禽类可感染此病。牛结核病最易感染奶牛，可通过呼吸道、消化道传播，妊娠母牛也可经过胎盘传播给胎儿。牛结核病是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和禽型分枝杆菌（Mycobacterium avium）引起，使肺、乳房、淋巴等多个组织以及器官内出现结节性肉芽肿和干酪性坏死灶，其中最常见的是肺结核，以渐进性消瘦、干咳和呼吸困难为典型症状。目前，牛分枝杆菌等引起的牛结核病不会在世界范围内造成严重威胁，但感染率仍呈上升趋势。要控制牛结核病的传播与流行，需要加强对牛结核病诊断技术的相关研究。本文简要概述了牛结核病的诊断方法，以期为牛结核病的早期诊断和及时治疗提供参考。

1 牛结核病实验室诊断方法

1.1 细菌学方法

诊断牛结核病的细菌学方法主要包括涂片镜检法、细菌培养法等。涂片镜检法是一种利用显微镜进行的简单快速检测方法，但存在敏感性低、检出阳性率低、无法区分死菌和活菌等问题。细菌培养法是通过分离培养疑似结核牛代谢物中的细菌，观察培养细菌的形态，从而判断是否为结核杆菌的方法。目前，有研究通过免疫磁分离法（IMS）获得完整的细胞，便于后续的PCR或分枝杆菌生长指示管法（MGIT）培养检测。Stewart 等[1]对使用IMS 处理和未使用IMS 处理的280 个牛淋巴结（206 个可见病变，74个无可见病变）分别进行牛分枝杆菌检测，结果发现，经过IMS 分离、富集后，有70.3%无可见病变淋巴结检测为阳性，未处理的淋巴结仅有2.7%为阳性[1]，进一步说明IMS方法处理样品能够有效浓缩目标物，避免基质对检测过程的干扰，缩短检测时间，提高灵敏度，提高临床样本中的牛分枝杆菌检测阳性率。但结核杆菌对营养需求较苛刻，生长缓慢，并且在初次培养牛型结核分枝杆菌时，需在36～37 ℃条件下培养5～8 w才会出现菌落，因此检出率低。目前，此类方法检出率低，实际生产应用较少。

1.2 分子生物学方法

1.2.1 聚合酶反应（PCR）方法

PCR是常用的诊断方法之一，此方法可以快速诊断结核[2]，缩短确诊时间，防止疾病广泛传播。Akhtar 等[3]对215头奶牛的奶样、鼻腔拭子进行牛结核病的PCR检测，确定了感染分枝杆菌的类型。Courcoul等[4]对牛结核病的细菌学方法、组织病理学方法和PCR等3种检测方法进行比较，发现PCR 方法特异性好，与组织病理学方法的敏感性相似，高于细菌学方法的敏感性。此外，PCR 检测结果与待检样品中脱氧核糖核酸（DNA）提取方式也有关。Cornejo等[5]利用C18-羧丙基甜菜碱处理法提取牛奶中的DNA 后进行牛分枝杆菌的PCR 检测，敏感性为94.1%，高于玻璃微珠法提取方法。但此方法对试验条件要求较高，分枝杆菌间的相互交叉干扰、样品中细菌过低过杂等均会造成假性结果。

1.2.2 荧光定量PCR

荧光定量PCR克服了普通PCR存在的一些不足，可作为检测牛结核病的补充诊断方法，结核病病原菌实时荧光PCR 检测方法已纳入国家标准。Sánchez-Carvajal 等[6]对肠系膜淋巴结、气管和咽喉淋巴结等新鲜组织样本进行DNA 提取后进行牛分枝杆菌的实时定量PCR 检测，结果发现，此方法敏感性和特异性分别为77.1%和99.4%。

1.2.3 巢式PCR

与常规PCR 相比，巢式PCR 提高了反应的特异性、灵敏性和准确性。Araújo 等[7]运用以rv2807 为引物的巢式PCR方法检测脑组织中的结核分枝杆菌，结果发现AN5株和H37Rv 株的检测灵敏度在DNA 水平上分别可达到1.5 pg 和6.1 pg，特异性为100%。Carvalho 等[8]运用多重PCR、巢式实时PCR方法分别对198头牛（尸检为疑似结核病病变）的结核分枝杆菌进行检测，结果发现，2 种方法分别在7%、28%样本中检出病原菌，说明巢式实时PCR比多重PCR 方法检测效率更高。Costa 等[9]运用以IS6110 为引物的半巢式PCR 方法与细菌培养法对来自牛、野猪、鹿和狐狸的128个组织样本进行比较研究，两种方法检测结果的kappa系数为0.859，半巢式PCR方法检测敏感性和特异性分别为98.2%和88.7%。

1.2.4 多重PCR

多重PCR可同时检出多种病原体，具有较高的特异性和敏感性，可用于结核分枝杆菌的快速检测鉴定，由Chambehian在1988年首次提出。Spositto等[10]对牛分枝杆菌的pncA基因（C169G突变）和结核分枝杆菌的IS6110序列进行多重PCR检测，成功区分鉴定了牛分枝杆菌和结核分枝杆菌。有研究对50 头牛鼻拭子进行DNA 分析，以筛选出的RvD1-Rv2031c 和IS6110 为引物进行多重PCR 检测，可检测出牛分枝杆菌和其他非牛分枝杆菌[11-12]，这可作为一种有效的、高度特异的宰前辅助方法应用于牛结核的日常监测。Chen 等[13]建立了一种结合多重PCR 和变性高效液相色谱分析的新方法，此方法以分枝杆菌属特异性16S rRNA 基因序列和结核分枝杆菌的IS6110、IS1081 为引物进行多重PCR检测，对84株菌株进行了验证，结果均未观察到交叉反应。此方法可在1 h内对提取纯化的DNA完成快速检测，检测限值为0.8～1.6 pg。豆玲[14]针对炭疽pX01、布鲁氏菌BM21 以及结核菌插入片段IS6110 设计3对特异性引物，建立了布病、炭疽、结核病三重PCR方法，该方法有较好的特异性，并且对炭疽、布鲁氏菌以及结核杆菌的敏感性分别在345、313 以及322 fg/μL 以下。多重PCR 对临床多种病原体混合感染的快速诊断提供了技术支撑。

1.2.5 环介导等温扩增反应（LAMP）

LAMP 具有简单快速、灵敏度高、不与其他分枝杆菌DNA 发生交叉反应等优点。Guo 等[15]分别对结核分枝杆菌hspX、gyrB 和IS6110 等3 个特异性基因进行LAMP 检测，同时与涂片镜检法、实时荧光定量PCR 方法进行比较研究。结果发现，3 种LAMP 方法的检测特异性均为100%，其中gyrB-LAMP 法可于1 h 内在浓度为60 CFU/mL的H37Rv悬液中检出结核分枝杆菌，灵敏性与实时荧光定量PCR相似，说明LAMP检测结核分枝杆菌和实时荧光定量PCR 方法有相似的灵敏度。LAMP 不需要PCR仪和昂贵的试剂，未来具有广泛的应用前景。

1.3 免疫学方法

1.3.1 牛型提纯结核菌素（PPD）皮内变态反应

PPD 皮内变态反应是最常用的牛结核病诊断方法。此方法成本低，便于在基层推广，但存在操作过程困难、耗时长、特异性差、重复性差、结果判定主观性较强、无法鉴别免疫动物和感染动物等问题。此方法的敏感性也会因接种部位不同而变化，Casal 等[16]发现，在颈前区进行试验的阳性结果概率会更高，后面可多考虑在颈前区部位进行皮试反应，使试验敏感性最大化。目前，部分地区将皮内变态反应作为牛结核病的检疫依据[17]，此方法减少了检疫中的交叉反应和假阳性[18]，排除了检出阳性中包含的非结核分枝杆菌感染和禽结核阳性，提高了特异性。

1.3.2 γ-干扰素（IFN-γ）检测法

IFN-γ检测法是一种灵敏度高、特异性强的牛结核病补充检测方法[19]。该方法直观性强，重复性好，易于标准化，可区分牛分枝杆菌和副结核或禽分枝杆菌等感染，是已纳入国家标准的牛结核病早期诊断方法。Gan等[20]研究表明，测定血液中γ-干扰素（IFN-γ） mRNA表达水平可确定牛结核病的感染情况，并且RT-qPCR 与ELISA 检测的相关性较好，准确性高于PPD皮内变态反应。房文斌等[21]运用皮内变态反应、IFN-γ检测法分别对牛型PPD皮内变态反应阳性牛进行检测，阳性吻合率分别为81.27%和88.24%；采用γ-干扰素体外检测法分别对牛型PPD 皮内变态反应可疑牛40头、阴性牛24头进行检测，检出阳性率分别为57.5%、20.83%，证明了IFN-γ体外检测法与比较变态反应相比具有快速、敏感性高、特异性强、可减少人为因素影响、提高检测结果准确性的优点。Elnaggar 等[22]研究表明，一种ESAT-6、CFP-10 细胞因子的流式细胞术可作为体外检测IFN-γ 法的替代方法，结核阳性动物在受到PPDB、ESAT-6/CFP-10 刺激后，体内的CD4+T（CD45R 0+CD69+）细胞产生IFN-γ，而未感染无变化[22]。但IFN-γ检测法仍存在一些不足，如IFN-γ测定临界值的选定对于结果影响很大[23]，检测成本较高，试验材料须在采集后尽快在实验室中刺激培养，操作专业性较强等。目前，IFN-γ检测法主要配合皮内变态试验进行牛结核病平行试验和系列试验[24-25]，应用于对皮内变态反应检出阳性或可疑牛进行复检。

1.3.3 白细胞介素-2（IL-2）检测法

IL-2主要由活化的T淋巴细胞释放，可作为细胞介导免疫反应的指标，也可作为传染性疾病诊断的潜在生物标志物。也有研究发现，当特异性分枝杆菌抗原CFP-10-ESAT-6 融合蛋白刺激时，流式细胞术检测感染牛体内CD4+T 细胞分泌IL-2 明显多于健康动物[26]。此方法比IFN-γ 检测、IFN-γ 流式细胞术诊断牛结核病的检测结果符合度高。

1.3.4 ELISA抗体检测方法

动物感染结核后，病原菌主要引起以细胞免疫为主的免疫应答，体液免疫相对滞后，检测牛血清抗体的ELISA方法的临床试验相对较少，但目前也有研究认为ELISA等抗体检测方法可作为辅助方法诊断牛结核病。Griffa等[27]试验发现，ELISA 抗体检测重复性高，变异系数为25%，Pearson 系数为0.964 8。Cho 等[28]分别以重组MPB70 和SahH（M70S）以及天然20 kda 蛋白（20K）作为抗原建立ELISA 检测方法，发现20K-ELISA 的敏感性和特异性分别为94.4%和98.2%，M70S-ELISA 的敏感性和特异性分别为94.4%和97.3%。Joseph 等[29]对123 头水牛分别通过PPD皮内变态反应、ELISA、PCR等3种试验方法进行牛结核病检测，结果发现，ELISA 和PCR 方法分别检出阳性率为8.94%和8.13%，ELISA 与PCR 一致性高（kappa 值为0.856），若与皮试变态反应一起使用，ELISA 和PCR 的敏感性更高，假阴性结果更少。

1.3.5 荧光偏振检测方法（FPA）

FPA 是通过荧光偏振仪测量由用荧光素标记的肤缀合物发射光的偏振状态以确定抗体是否存在，以确定感染情况。Surujballi 等[30]以荧光素标记的MPB70 蛋白作为抗原进行FPA检测，结果发现，在ROC曲线分析建议的截断点，FPA 检测的敏感性、特异性分别为92.9%、98.3%，并对副结核分枝杆菌感染动物无交叉反应，后续可作为检测牛分枝杆菌感染的准确指标。

1.3.6 其他方法

动物体内的淋巴细胞和髓细胞在不同程度上参与了对结核菌的免疫反应，致敏的外周血淋巴细胞在特异性抗原刺激下会产生增殖反应，因此可以测定淋巴细胞增殖的程度，判断淋巴细胞被特异性抗原致敏的程度以及机体对牛分枝杆菌的细胞免疫状态。中性粒细胞也在免疫反应中发挥了重要作用，感染牛结核病的牛的阳性血清可诱导健康中性粒细胞核固缩、肿胀、凋亡[31]，而未感染的牛无变化，因此中性粒细胞检测可成为确定牛结核病感染的辅助诊断方法。

此外，有学者认为，分析生物样本释放的挥发性有机化合物（VOCs）可以进行牛结核病诊断。Brebu 等[32]分析了来自罗马尼亚3 个农场的18 头被诊断患有牛结核病奶牛和来自同一农场的27头牛结核阴性奶牛，对呼吸、粪便和皮肤释放的VOC 样本进行气相色谱-质谱联用分析研究。结果发现：在通过呼吸释放出80 种VOCs、粪便释放出200种VOCs、皮肤释放出80种VOCs 中，共统计分析出了3种试探性呼吸VOC生物标志物、9种粪便VOC生物标志物和3 种试验性皮肤VOC 生物标志物。但此种方法仍处于初级研究阶段，未来可成为牛结核病筛查的另一种诊断方法。

2 牛结核病诊断方法应用现状

在牛结核病的诊断方法中，细菌学方法已不能满足临床检测诊断牛结核病的需要，不适于基层应用，未被广泛应用。分子生物学方法一般具备较强的敏感性和特异性，但检测过程需要特定的仪器设备，检测技术要求较强，对操作人员以及实验室条件提出了一定的要求，此类方法主要在实验室研究中应用。目前，免疫学方法是牛结核病实验室诊断方法中应用最广泛的一类方法。大多数国家也主要采用PPD 皮内变态反应和体外检测IFN-γ 法联合使用进行诊断以确定结核阳性牛。

目前，我国牛结核病主要以“监测、检疫、扑杀和消毒”相结合的方式进行综合性防治，分类指导、因场施策、逐步净化，积极开展场群和区域净化工作。在我国现阶段的检测方法中，从价格、实用性、准确性等方面出发，最优选的确诊方法主要是先用PPD皮内变态反应进行初筛，再通过IFN-γ 检测法确诊，这两种方法具有互补关系，也是减少牛结核病流行的有效方法。

3 展望

牛结核病呈现宿主范围广、感染基数大、病程缓慢、发病数相对较少的特点，给牛生产养殖业造成一定的损失。目前，控制牛结核病的主要措施是通过定期对牛群进行检疫以根除病牛。

虽然世界各国致力于研究开发牛结核病的新型快速诊断技术，但目前的牛结核诊断的方法可能只适合疫病进展的一个阶段，但不一定适用于其他阶段，仍缺乏一种敏感、快速、特异性强、精准诊断牛结核病的方法，这对牛结核病的防控造成了困扰。后续应进一步对牛结核病诊断方法进行研究，以保障畜牧业健康发展和公共卫生安全。