Sirt6与狼疮性肾炎足细胞损伤的关系

魏玉娇,陈超,周燕,刘南池,马瑞霞

(青岛大学附属医院,山东 青岛 266003 1 肾病科; 2 心血管内科)

狼疮性肾炎(LN)是系统性红斑狼疮(SLE)病人最常见及最严重的并发症之一,是影响SLE病人预后的主要因素[1]。LN以蛋白尿、镜下血尿、进行性肾功能损害为主要特点,其中蛋白尿是LN的主要临床表现,是判断疾病活动性的重要指标[2]。足细胞是肾小球滤过膜的重要组成部分,对维持肾功能具有重要作用。研究发现,足细胞损伤是LN病人蛋白尿的发病机制之一[3],其损伤程度是终末期肾病的主要预后决定因素[4]。LN病人足细胞损伤的机制仍不清楚,可能与免疫复合物沉积、补体激活、炎症反应、细胞凋亡及自噬有关[5]。Sirtuins是一类进化保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性组蛋白脱乙酰化酶[6],哺乳动物Sirtuins蛋白家族共包括7个成员(Sirt1～7)。沉默调节蛋白6(Sirt6)是Sirtuins蛋白家族中较为重要的一员,主要通过去乙酰化H3K9、H3K59抑制炎症反应及细胞凋亡、促进DNA修复、调节葡萄糖稳态,参与多种疾病的发生发展过程[7]。有研究发现,Sirt6在糖尿病肾病(DN)中表达降低,而诱导Sirt6高表达可通过激活AMPK途径维持足细胞线粒体稳态、减少足细胞凋亡,发挥肾脏保护作用[8]。目前国内外有关Sirt6在LN中的作用研究甚少。本研究拟探讨Sirt6与LN病人足细胞损伤的关系及相关机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入研究对象为2018年1月—2020年1月于我院肾病科住院治疗、诊断明确的LN病人70例,平均年龄(31.72±7.92)岁。纳入标准:①符合2012年系统性红斑狼疮国际临床协作组(SLICC)制定的SLE诊断标准[9],伴有肾脏损害的临床表现(蛋白尿、血尿或肾功能不全);②年龄>18周岁;③初治且经肾脏穿刺活检病理确诊为LN;④所有病人均有完整的病史、实验室检查资料,且女性病人均未在妊娠期。所有病人均排除肾小球或肾间质性肾炎等原发和继发性肾脏疾病。根据SLE疾病活动度评分(SLEDAI评分)[10]分为活动组(≥7分)47例、非活动组(≤7分)23例。同时选择性别、年龄相匹配的因肾外伤行肾脏切除的病人(肾脏组织光镜检查证实为正常肾组织)15例作为对照组。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会审核批准,且全部纳入对象均签署知情同意书。

1.2 临床资料收集

收集研究对象的临床资料及实验室检查结果,实验室检查结果包括24 h尿蛋白定量(24hUP)、血红蛋白(HB)、血小板(PLT)、血清清蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、胆固醇(CH)、三酰甘油(TG)、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、补体C3(C3)、补体C4(C4)、抗双链DNA抗体(anti-dsDNA)、抗核抗体(ANA)以及肾小球滤过率估计值(eGFR,CKD-EPI法计算)。

1.3 肾脏病理检查

病人于B超引导下行肾穿刺活检术,肾组织活检标本制成3 μm厚的石蜡包埋切片,常规行HE染色,光镜观察肾组织结构,电镜观察肾小球足细胞。LN肾脏病理分型根据2012年SLICC诊断标准[1]。病理分型采用2003年国际肾脏病协会和肾脏病理学会(ISN/RPS)标准[11]。

1.4 免疫组化染色方法检测Nephrin、Sirt6表达

肾组织活检标本石蜡包埋、切片,使用二甲苯、不同浓度梯度的乙醇溶液进行脱蜡、水化,内源性过氧化物酶封闭抗原。洗涤后分别加入单克隆兔抗人Nephrin抗体(1∶1 000,ab216341,Abcam,Cambridge,MA,USA)、Sirt6抗体(1∶1 000,ab62739,Abcam,Cambridge,MA,USA),洗涤后37 ℃下加入山羊抗兔IgG抗体(1∶200,PV9001,北京中杉金桥公司)孵育30 min,苏木精复染、风干,二甲苯脱色后封片,显微镜下观察。Nephrin、Sirt6阳性染色均为棕色。每张切片选取10个视野,使用IPP软件(Insilicos,Seattle,WA,USA)分别计算肾组织中Nephrin、Sirt6的阳性染色面积,取其平均值。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 各组病人临床资料比较

与对照组比较,LN非活动组病人HB、PLT、ALB、C3、C4明显降低, 24hUP、ESR、CRP升高,差异有统计学意义(F=7.64～120.60,P<0.05),CH、TG、Scr、BUN差异无统计学意义(P>0.05);与LN非活动组相比,LN活动组病人HB、ALB、C3、C4、eGFR明显降低,而24hUP、SCr、BUN、CH、ESR明显升高,差异有统计学意义(F=6.17～120.60,P<0.05)。见表1。

表1 各组临床资料比较

2.2 各组肾组织光镜、电镜观察结果比较

HE染色光镜观察显示,LN病人肾小球体积增大,系膜区增宽,系膜细胞及系膜基质增多,且活动组变化更明显(图1)。电镜观察显示,对照组肾小球足突完整、排列规则,基底膜连续;LN组肾小球系膜细胞、系膜基质明显增生,基底膜不均匀增厚,足突弥漫融合甚至消失,且活动组变化更明显(图2)。

A:对照组;B:LN非活动组:C:LN活动组。HE染色,放大200倍。

2.3 各组足细胞Nephrin表达水平比较

免疫组化染色显示,对照组足细胞Nephrin表达明显,呈连续、线性分布;LN组足细胞Nephrin表达降低,分布不均,且LN活动组较非活动组降低更明显,差异有统计学意义(F=133.61,P<0.05)。见图3、表2。

A:对照组;B:LN非活动组:C:LN活动组。放大400倍。

表2 各组Nephrin及Sirt6表达比较

2.4 肾组织Sirt6表达水平比较

免疫组化染色显示,对照组Sirt6均匀分布在肾小球、肾小管及肾间质中,且主要分布在肾小球细胞核中;LN组Sirt6表达降低,分布不均,且LN活动组较非活动组降低更明显,差异有统计学意义(F=103.65,P<0.05)。见图4、表2。

A:对照组;B:LN非活动组:C:LN活动组。放大400倍。

2.5 肾组织Sirt6表达与24hUP、ESR、C3、ALB等临床指标的相关性

Spearman相关性分析显示,肾组织中Sirt6表达水平与24hUP(r=-0.580,P<0.01)、ESR(r=-0.559,P<0.01)呈负相关,与C3(r=0.670,P<0.01)、ALB(r=0.660,P<0.01)呈正相关。见图5。

图5 Sirt6与临床指标的相关性散点图

2.6 肾组织Sirt6表达与足细胞Nephrin表达及SLEDAI评分的相关性

Spearman相关性分析显示,肾组织Sirt6表达与足细胞Nephrin表达呈显著正相关(r=0.954,P<0.01),而与SLEDAI评分呈显著负相关(r=-0.666,P<0.01)。见图6。

图6 肾组织Sirt6与足细胞Nephrin及疾病活动性的相关性散点图

3 讨 论

SLE是一种伴有全身多器官损害的自身免疫性疾病,以血清中出现抗核抗体(ANA)等多种自身抗体为主要特征[11]。LN是SLE最常见的器官损害之一,是判断疾病进展及预后的重要指标。LN的发病机制尚不清楚,迄今为止,越来越多的研究强调足细胞损伤在LN发病中具有重要作用[12]。足细胞是高度分化的细胞,位于鲍曼囊内侧,包裹着肾小球毛细血管。足细胞通过表达突触素、Nephrin、Podocin和Wilms肿瘤蛋白等标志物,在维持肾小球滤过屏障完整性及维持肾功能方面发挥重要作用[13]。本研究光镜、电镜观察发现,LN病人肾小球基底膜增厚,系膜细胞及系膜基质增生,足突弥漫融合甚至消失;免疫组化染色显示,足细胞Nephrin表达降低,且活动组降低更明显,提示LN病人存在足细胞损伤。本文结果还显示,Nephrin表达水平与24hUP负相关,提示Nephrin可能与疾病活动性有关。LN足细胞损伤的具体机制尚未明确,可能与免疫复合物沉积、补体激活、淋巴细胞浸润、细胞凋亡及自噬有关[5,14]。有研究发现,Sirtuins蛋白家族广泛参与足细胞稳态及肾功能的维持[15]。

Sirt6是Sirtuins蛋白家族中最为重要的一员,其在雄性小鼠中过表达可增加小鼠寿命,是目前公认的“长寿蛋白”[16]。Sirt6位于人类19号染色体13.3端,有两个异构体,分别由8个外显子和7个外显子编码355和328个氨基酸长度的蛋白。Sirt6蛋白结构由高度保守的核心催化区、N端组蛋白去乙酰化酶功能区及C端核定位信号组成。Sirt6的空间结构包含1个由氢键连接的锌指蛋白结合域及Rossman折叠区共同维持Sirt6空间构象的稳定性[17]。Sirt6可以通过抑制肾脏炎症、纤维化、促进自噬参与足细胞的稳态和肾功能的维持[9,18]。最近研究发现,Sirt6参与DN的发生及发展过程[8,15,19],但其在LN中的作用尚不清楚。本研究发现,Sirt6阳性染色均匀分布在肾小球、肾小管及肾间质中,且主要分布在肾小球细胞核中,与LIU等[20]研究结果相一致。推测肾组织Sirt6可能在细胞核和细胞浆中穿梭,其定位主要取决于细胞类型或环境因素。

本文研究结果显示,与对照组相比,LN病人肾组织Sirt6表达降低,且LN活动组较非活动组降低更明显;Sirt6表达水平与足细胞Nephrin表达呈正相关,而且Sirt6表达水平与24hUP、SLEDAI评分、ESR明显负相关,与ALB、C3正相关。提示Sirt6参与LN足细胞的损伤,其表达水平可能与疾病活动性有关。既往研究发现,Sirt6通过去乙酰化组蛋白H3K9抑制Notch1、Notch4信号转录,发挥抗炎、抗凋亡及促进自噬的作用保护足细胞[20]。还有研究指出,Sirt6通过上调Bcl-2和CD206的表达、降低Bax和CD86的表达,激活巨噬细胞向M2型转化,保护足细胞免受高糖诱导的损伤[21]。因此猜测,Sirt6在LN中也可能通过调节巨噬细胞表型的转化参与足细胞的损伤。今后将扩大样本量,进行体内外实验及动物实验进一步探讨Sirt6在LN病人足细胞损伤中的具体作用。

综上所述,LN病人肾组织Sirt6的表达明显降低,且与足细胞Nephrin表达正相关,与疾病活动性负相关。Sirt6在LN足细胞损伤中的发病机制仍需进一步探讨。