基于大气压化学电离的GC-MS/MS法测定动物源性食品中8 种酰胺类除草剂残留

杨志金，林彬彬，黄旭良，陈倩妮，林小莲，蓝燕珊

（厦门市食品药品质量检验研究院，福建 厦门 361013）

酰胺类除草剂是一类具有R1(R2)—N—CO—R3结构通式的除草剂，能除去一年生禾本科及若干阔叶杂草，广泛用于大豆、玉米、花生、棉花的种植，具有除草谱广、效果突出、施用方便、价格低廉等优点，在全球除草剂市场中位列第三[1]。由于酰胺类除草剂水溶性较强、土壤吸附常数较低，容易通过渗透转移到浅层地下水或随雨水径流进入地表水，附着在土壤及沉积物中，再通过生物富集、积累和放大，对生态系统和人类健康产生危害[2]。

大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）是一种可产生较少碎片的“软”电离技术，在液相色谱-串联质谱中已成熟应用于弱极性和非极性化合物测定[3]。传统的气相色谱-电子电离串联质谱（gas chromatography-electron impact-tandem mass spectrometry，GC-EI-MS/MS）只能选择目标物的碎片离子，作为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）的母离子。基于APCI的气相色谱-串联质谱（GC-APCI-MS/MS）可产生目标物的分子离子或准分子离子，从而形成高选择性和高灵敏度的MRM通道，为定性和定量分析提供理想的条件[4]。Van Bavel等[5]应用于食品和环境样品中二噁英的稳定、精确定量，通过跨实验室比对发现可替代传统的高分辨磁质谱[6-7]，已获得欧盟法规EU 2017/644[8]（食品）和EU 2017/771[9]（饲料）作为确证方法的认可。耿霞等[10]应用于改善食品和环境分析中10 种多溴联苯和28 种多溴联苯醚的定量和定性分析能力。Raro等[11-12]应用于兴奋剂控制分析中筛选和测定外源性合成代谢雄激素类固醇。郁欢欢等[13]应用于蔬菜中农药残留测定，23 种农药在0.01～20.00 μg/L范围内线性良好，该方法抗基质干扰能力较强，具有良好的适用性。

动物源性食品基质复杂，通常含有较高含量的磷脂、蛋白质、油脂、糖类等内源性干扰物，前处理多采用凝胶渗透色谱净化[14-15]、固相萃取[16-17]、QuEChERS[18-19]。酰胺类除草剂测定多采用气相色谱[20-21]、GC-MS[22-23]、GC-MS/MS[24-26]、液相色谱[27]和液相色谱-串联质谱[28-31]。目前，GC-APCI-MS/MS在农药残留检测中尚未推广应用，对酰胺类除草剂的检测鲜见报道。本研究采用基于APCI的GC-MS/MS检测技术，选择增强型脂质去除产品EMR-Lipid净化，改进氮吹浓缩转换溶剂为溶剂稀释，建立动物源性食品中甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、敌草胺、吡唑草胺、二甲吩草胺、异丙甲草胺的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶 市售。

甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、敌草胺、异丙甲草胺标准溶液 农业农村部环境保护科研监测所；吡唑草胺、二甲吩草胺标准溶液 德国Dr Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、乙腈（均为色谱纯）德国Merck公司；QuEChERS萃取盐包（含6 g无水硫酸镁、1.5 g乙酸钠）天津博纳艾杰尔科技有限公司；EMRLipid dSPE净化管（含1 g增强型脂质去除材料）、EMRLipid Polish反萃管（含1.6 g NaCl、0.4 g无水MgSO4）、陶瓷均质子 美国Agilent公司；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

7890B-Xevo TQ-XS气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（配APCI源）美国Waters公司；GM 200刀式研磨仪 德国Retsch公司；Vortex 4 Basic涡旋混合器 德国IKA公司；CF15RN高速冷冻离心机日本Hitachi公司；Research plus单道手动可调移液器 德国Eppendorf公司；Milli-Q超纯水发生器美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气高纯氦气，恒定柱流量1.2 mL/min，进样口温度280 ℃，脉冲不分流进样，脉冲压力32 psi，持续时间1.2 min，柱箱温度初始60 ℃保持1 min，以40 ℃/min升到170 ℃，再以10 ℃/min升到300 ℃保持3 min；色谱-质谱接口温度280 ℃，进样体积1 μL。

1.3.2 质谱条件

APCI源；正离子扫描；MRM扫描模式；离子源温度150 ℃；电晕针电流0～3 min为20 μA，3 min后为8 μA；辅助气（N2）流量400 L/h；锥孔气（N2）流量0～3 min为0 L/h，3 min后为250 L/h；喷雾器压力7.0 bar；碰撞气（Ar）流量0.15 mL/min；色谱柱出口尾吹气（N2）流量350 mL/min。

1.3.3 标准溶液配制

混合标准中间液（1.0 mg/L）：将标准溶液稀释成10.0 mg/L的储备液，储存于－18 ℃，各取1.0 mL储备液混合，用乙酸乙酯定容10 mL。

溶剂配制标准溶液：吸取一定体积的混合标准中间液，用乙腈-乙酸乙酯溶液（1∶9，V/V）稀释成质量浓度为0.5～50.0 μg/L的系列标准工作溶液。

基质匹配标准溶液：吸取一定体积的混合标准中间液，用样品前处理得到的溶液稀释成质量浓度为0.5～50.0 μg/L的系列标准工作溶液。

1.3.4 样品的前处理

称取5 g制备试样，加入5 mL水（牛奶不加水）、10.0 mL乙腈及1 颗陶瓷均质子，涡旋混合1 min，超声提取10 min。加入QuEChERS萃取盐包，涡旋混匀1 min，4 500 r/min离心10 min，吸取5 mL上清液加入预先用3 mL水活化的EMR-Lipid dSPE净化管中，并放入1 颗陶瓷均质子，涡旋振荡1 min，将上述上清液倒入EMR-Lipid Polish反萃管并放入1 颗陶瓷均质子，涡旋振荡1 min，9 000 r/min低温高速离心5 min，取上清液过微孔滤膜，按乙腈滤液-乙酸乙酯（1∶9，V/V）进行混匀。

1.3.5 基质效应（matrix effect，ME）评估

吸取一定体积混合标准中间液，分别用乙酸乙酯和空白样品前处理得到的溶液，配制系列梯度标准溶液，由标准溶液得到的回归方程斜率，ME计算公式如下：

ME＞0%为基质增强效应，ME＜0%为基质减弱效应；|ME|＜20%为弱ME，20%≤|ME|≤50%为中等程度ME，|ME|＞50%为强ME。

1.4 数据处理

数据采集和定性定量采用MassLynx V4.2 SCN982，数据统计采用Excel（2016版），图像处理采用Origin 2018。

2 结果与分析

2.1 质谱参数优化

APCI的电离发生在大气压环境，由于电离室内存在氮气分子和微量水分，通过电晕针放电使化合物电离的过程出现2 种模式：电荷转移M＋·和质子化[M＋H]＋[32]。由于酰胺基—N—(C＝O)—中的氧原子有1 对孤对电子，可与氢质子结合，容易产生[M＋H]＋峰，因此选择质子化模式。在优化确定APCI离子源的电晕针电流、辅助气流量、锥孔气流量后，对锥孔电压、特征子离子及其碰撞能量等质谱参数进行优化，选取响应强度高、干扰小的2 对离子作为定量定性离子，建立MRM方法，优化的质谱参数见表1，选择离子色谱图见图1。

图1 8 种酰胺类除草剂标准品的MRM色谱图（10.0 μg/L）Fig.1 MRM chromatograms of eight amide herbicide standards(10.0 μg/L)

表1 8 种酰胺类除草剂的质谱参数及保留时间Table 1 MS parameters and retention times of eight amide herbicides

2.2 前处理方法确定

有学者尝试将QuEChERS应用于动物源性食品的前处理[33-34]，通过增加乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（ethylenediamine-N-propylsilane silica gel，PSA）和十八烷基键合硅胶（C18）用量，吸附提取液中的磷脂和脂肪类化合物。增强型脂质去除产品EMR-Lipid是一种新型高聚物吸附材料[35]，与QuEChERS具有类似的操作流程。对样品处理后的溶液进行m/z50～500全扫描，考察吸附剂EMR-Lipid、50 mg/mL PSA＋50 mg/mL C18分别对猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶的净化效果。如图2所示，4 种基质在5～9 min的低沸点（＜200 ℃）杂质较少，猪肉、猪肝在10～14 min的中等沸点（230～280 ℃）杂质较多，鸡蛋、牛奶在高于16 min的高沸点（＞300 ℃）较多，50 mg/mL PSA＋50 mg/mL C18对4 种基质均起到一定的净化效果，但EMR-Lipid材料的净化效果更为显著。因此，选用乙腈提取、EMR-Lipid材料净化作为前处理方法。

图2 EMR-Lipid与50 mg/mL PSA＋50 mg/mL C18的净化效果对比Fig.2 Comparison of purification efficiency between EMR-Lipid and 50 mg/mL PSA+50 mg/mL C18

2.3 净化后溶剂转换优化

样品前处理使用乙腈提取后的溶液较为清澈，色素和油脂等共萃物较少，在盐析作用下乙腈可与水分离。乙腈作为溶剂直接进样，会使弱极性气相色谱柱的固定相加速流失，出现柱效下降、溶剂峰拖尾及色谱峰裂分等问题。因此需要将乙腈浓缩至干，再用弱极性或非极性溶剂复溶，这个过程容易造成目标物的损失。为考察溶剂转换过程中8 种酰胺类除草剂的损失，分别制备10 μg/L的猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶基质匹配标准溶液，按1∶1∶1∶1（体积比）混合混匀，进行氮吹浓缩至干，再用等体积乙酸乙酯溶液复溶，平行测定6 次计算平均回收率。如图3所示，溶剂转换过程对8 种酰胺类除草剂均造成一定的损失，平均回收率为64.1%～76.8%，个别平行样的回收率低于60%，说明氮吹过程的回收率受氮吹操作、近干状态判断等影响，从而影响检验结果的准确性。

图3 8 种酰胺类除草剂经溶剂转换后的平均回收率Fig.3 Average recoveries of eight amide herbicides after solvent conversion

在满足检测灵敏度的前提下，研究使用溶剂稀释代替溶剂转换。比较GC进样常用的有机溶剂，正己烷与乙腈不互溶，丙酮可与乙腈互溶但与弱极性色谱柱的相容性较差，乙酸乙酯可与乙腈互溶且极性较弱，最终选择用乙酸乙酯对乙腈净化液进行稀释。溶剂稀释代替溶剂转换，可避免溶剂转换造成的目标物损失，简化样品前处理的流程提高效率，减少基质进样量降低基质干扰，但对分析仪器的灵敏度提出更高的要求。

2.4 ME评估

采用提取净化后加标法，配制质量浓度为1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 μg/L的溶剂标准液和基质标准液，对8 种酰胺类除草剂在猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶中的ME进行考察。如表2所示，同一除草剂在不同动物源食品中的ME具有较大差异，4 种动物源性食品中的ME在－11%～12%之间，为弱ME，这可能是净化后的稀释操作，有利于降低或消除ME。

表2 8 种酰胺类除草剂在猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶中的METable 2 Matrix effects of eight amide herbicides in pork,pig liver,eggs and milk %

2.5 方法学验证

2.5.1 方法的线性范围、检出限与定量限结果

配制质量浓度为0.10～100 μg/L系列混合标准工作液进行测定，以质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并作线性回归分析，得到标准曲线的线性方程和线性范围。如表3所示，8 种酰胺类除草剂在0.50～50 μg/L范围内线性良好，R2＞0.99。在空白样品中添加8 种酰胺类除草剂，以RSN=3确定检出限，以RSN=10确定定量限，检出限为0.029～1.3 μg/kg，定量限为0.095～4.2 μg/kg。

表3 8 种酰胺类除草剂的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs for eight amide herbicides

为比较GC-APCI-MS/MS测定8 种酰胺类除草剂的优势，采用传统的GC-EI-MS/MS测定作对比，色谱条件与GC-APCI-MS/MS相同，质谱参数来自GB 23200.113—2018《植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》[36]。如图4所示，GC-EI-MS/MS测定的定量限均高于GC-APCI-MS/MS，两者的比值达到4.62～310，说明GC-APCI-MS/MS具有更高的检测灵敏度，超出的灵敏度空间允许前处理对样品进行稀释，为净化后的溶剂稀释代替溶剂转换提供灵敏度保障。

2.5.2 方法的回收率与精密度结果

采用样品添加法，在猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶的空白样品中，分别添加不同质量浓度的混合标准溶液，制成低（10 μg/kg）、中（20 μg/kg）、高（100 μg/kg）3 个水平的加标样品，每个添加水平重复6 次，基质匹配外标法计算平均回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法的回收率与精密度。如表4所示，8 种酰胺类除草剂在4 种动物源性食品中的加标回收率和RSD分别为63.3%～108%和2.51%～13.8%，方法具有较好的回收率和重复性。

表4 8 种酰胺类除草剂在4 种动物源性食品中的加标回收率和精密度Table 4 Spiked recoveries and precision of eight amide herbicides in four animal-derived foods

2.5.3 实际样品分析结果

随机购买市售猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、猪肝、猪肾、鱼肉、虾肉、蟹肉、花蛤、鸡蛋、牛奶、蜂蜜、蜂王浆各1 份，应用本方法测定8 种酰胺类除草剂，样品中均未检出。

3 结论

本研究建立基于大气压化学电离的GC-MS/MS法，测定动物源性食品中甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、敌草胺、吡唑草胺、二甲吩草胺、异丙甲草胺残留。采用乙腈提取、EMR-Lipid材料净化的前处理方法，去除提取液中的磷脂和脂质，使用乙酸乙酯稀释乙腈净化液，避免溶剂转换造成的目标物损失。在猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶中进行方法学验证和ME评估，方法的准确度和精密度较好，ME弱。该方法可简便、高效、准确、灵敏地适用于动物源性食品中8 种酰胺类除草剂的快速定量测定。