荜茇调控铁死亡治疗肺癌的作用机制*

李梦珂,常思思,高付彦,卢娟娟,李洪霖

1.河南中医药大学,河南 郑州 450046; 2.河南中医药大学第二附属医院/河南省中医院,河南 郑州 450002

根据2020年全球癌症统计数据显示,目前肺癌的发生率排名第2,病死率排名第1[1],我国肺癌的发生率及病死率均排名第1[2]。中医认为,肺癌病位在肺,本质是机体阳气运化不足,阴寒积聚,导致体内阴阳失调,故在治疗时以扶阳抑阴为原则,可选用温阳类药物温化扶阳、培元固本,以达到阴平阳秘的目的。

荜茇性辛、热,属于温阳类药物,其功效为温中散寒、下气止痛。有研究证实,荜茇及其主要活性成分在治疗肺癌过程中能发挥重要作用;荜茇酰胺可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡,是一种可能的抗肺癌天然产物[3]。荜茇明碱能够抑制小鼠瘤块血管内皮生长因子基因的表达,减慢肿瘤生长的速度[4]。通过进行胡椒碱对人肺癌细胞(A549)和人肺成纤维细胞(W138)的作用实验,发现胡椒碱能抑制细胞增殖,也能诱导A549凋亡[5]。

铁死亡是一种程序性细胞死亡,区别于细胞凋亡与坏死,主要是由于铁依赖性脂质过氧化物出现了损伤从而诱导了细胞的死亡[6]。有研究认为,铁死亡发生的机制主要与铁代谢、氨基酸和谷胱甘肽代谢、脂质代谢有关[7]。调控铁死亡对肿瘤的治疗起着很重要的作用,有可能成为治疗肿瘤的新方式[8]。有研究表明,荜茇活性成分能通过调控铁死亡过程而延缓肿瘤的发生发展[9-10],但机制尚未明确。

网络药理学是通过构建网络模型来分析药物靶点与疾病基因之间相关性的一种方法[11]。本研究基于网络药理学探讨荜茇调控铁死亡治疗肺癌可能的作用机制,为临床治疗肺癌提供依据。

1 材料与方法

1.1 荜茇有效活性成分获取及筛选以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性指数(drug like index,DL)≥0.18[12]为筛选条件在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)中检索收集荜茇主要活性成分。

1.2 荜茇有效活性成分作用靶点获取及筛选运用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)对1.1所得结果进行靶点基因整理,得到标准化靶点蛋白名称、荜茇潜在作用靶点,创建荜茇活性成分靶点数据库。

1.3 肺癌靶点收集在Gene Cards数据库中以“lung cancer”(http://www.genecards.org/)为关键词,搜索与肺癌相关的基因,整理后创建肺癌靶点数据库。

1.4 荜茇作用靶点和肺癌作用靶点取交集及蛋白对荜茇主要活性成分作用的靶点和肺癌作用靶点取交集基因,得到荜茇治疗肺癌的潜在作用靶点。然后输入String数据库,获得蛋白质互作网络(protein-protein interaction networks,PPI),构建PPI作用网络。

1.5 基因功能分析和通路富集分析运用R软件对上述基因进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。在程序语言中,定义为P<0.05,Q<0.05,以条形图形式将分析结果输出。

1.6 铁死亡调控基因获取及其与荜茇、肺癌三者靶点综合分析运用FerrDb数据库[13]和韦恩分析工具获得铁死亡调控基因与荜茇参与调控肺癌的靶基因的公共基因,即上述荜茇通过调控铁死亡治疗肺癌的靶点。然后使用R软件对已获取的三者之间的公共基因组进行KEGG信号通路分析,将分析结果以条形图形式输出,并通过String数据库构建PPI网络。

1.7 临床样本含量分析运用TCGA分析得出的公共基因在临床表达差异情况。

2 结果

2.1 荜茇活性成分的筛选在TCMSP中通过筛选得到15个有效活性成分,去除重复靶点后得到158个有效靶点,然后运用Uniprot数据库转化基因ID。

2.2 荜茇作用靶点与肺癌作用靶点的交集在GeneCards中共获得肺癌相关疾病靶点23 469个,然后将其与药物有效靶点基因进行比对,得到13个有效活性成分(表1)和68个关键靶点,所得即为荜茇治疗肺癌潜在的靶点基因。

表1 荜茇有效活性成分及对应靶点数

2.3 荜茇主要有效活性成分、肺癌、靶点相互作用网络图通过Cytoscape 3.8.0将荜茇主要有效活性成分及其作用靶点和肺癌作用靶点进行可视化分析,发现荜茇通过多成分-多靶点-多通路治疗肺癌的作用机制(图1)。

注:紫色代表药物荜茇,红色代表肺癌,蓝色代表药物有效活性成分,绿色代表共同基因靶点。图1 荜茇活性成分-肺癌靶点网络图

2.4 PPI的构建及其核心网络的筛选将得到的68个交集基因输入String数据库,选择限制物种为“Homo Sapiens”,然后取前30个基因进行可视化,绘制PPI网络及柱状图。得到结果包括68个节点,272条边,平均节点度值8。图中的节点代表蛋白质,边代表蛋白质之间的关系(图2、图3)。荜茇与肺癌的PPI结果显示,IL-10、FOS、ACOX1、IL-6、CREB1等靶点度值相对较高,在肺癌的发生、发展、侵袭、转移等各种细胞生物活动均有很大的关系[14-18]。

图2 荜茇与肺癌的蛋白质相互作用核心网络图

图3 每个基因的度值

2.5 GO功能富集分析对68个荜茇治疗肺癌的关键靶点进行GO功能富集分析,共得到104个富集结果。根据校正后P值大小对关键靶基因进行排序,展示前20位GO功能富集分析结果(表2、图4)。结果显示,荜茇主要参与G蛋白耦联胺受体活性、G蛋白耦联神经递质受体活性、神经递质受体活性、突触后神经递质受体活性、G蛋白耦联血清素受体活性、乙酰胆碱受体活性、烯酰辅酶A水合酶活性、儿茶酚胺结合、黄素腺嘌呤二核苷酸结合等。

图4 关键靶点的GO功能富集分析

表2 GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析对荜茇治疗肺癌的68个关键靶点进行KEGG通路富集分析,结果显示共富集在68条通路上,根据校正后P值进行排序,展示前20位KEGG通路富集分析(表3、图5)。荜茇治疗肺癌的信号通路主要包括TNF信号通路、神经活性配体-受体相互作用、c GMP-PKG信号通路、胆碱能突触通路、脂质和动脉粥样硬化通路、化学致癌-受体激活、IL-17、AGE-REGE信号通路、钙信号通道、心肌细胞的肾上腺素能信号等信号通路。

图5 关键靶点的KEGG通路富集分析

表3 KEGG 通路富集分析

2.7 铁死亡调控因子的获取及其与荜茇、肺癌三者共同基因筛选和分析在FerrDb中获得259个与铁死亡相关的基因,将其与68个荜茇和肺癌的公共基因进行韦恩分析(图6),获得5个基因,分别为IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD。这5个基因既是荜茇的作用靶点也是肺癌治疗靶点,同时也是铁死亡过程调控基因,对其进行KEGG通路分析,筛选条件为P<0.05,共得到阿尔茨海默病、神经退行性疾病-多种疾病通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、C型凝集素受体信号通路、TNF信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、脂质和动脉粥样硬化、人巨细胞病毒感染9条信号通路(图7)。

图6 荜茇调控铁死亡治疗肺癌的靶点

图7 荜茇调控铁死亡治疗肺癌的信号通路

对上述5个基因绘制PPI网络图(图8),结果显示,这5个基因之间相互联系。另外,通过对比发现荜茇调控铁死亡途径的靶点与荜茇治疗肺癌的核心靶点有重合,推测荜茇可以通过调控铁死亡途径发挥治疗肺癌的重要作用。

图8 荜茇调控铁死亡治疗肺癌靶点间的PPI网络图

2.8 TCGA数据库分析结果IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD 5个基因在临床标本数据库中正常组织与肿瘤组织中的表达存在显著差异(P<0.05)(图9)。其中,NOX1、G6PD在肿瘤组织中相对高表达,IL-6、PTGS2在肿瘤组织中的表达量则低于正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

本研究利用网络药理学分析药物-靶点-疾病的相互作用关系[19],构建网络关联,初步得出荜茇的主要活性成分、肺癌靶点、关键功能靶点,和荜茇通过调控铁死亡过程防治肺癌的相关通路。通过分析共得到IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD 5个公共靶点,说明荜茇通过这5个基因调控铁死亡起到治疗肺癌的作用。

本研究通过对荜茇有效活性成分的挖掘,发现荜茇的有效活性成分中主要包括生物碱及酰胺类等,其中胡椒碱、芝麻素、荜茇酰胺3者是网络系统中较为核心的成分,提示这3种有效活性成分对肺癌有治疗作用。研究显示,胡椒碱具有很强的抗肿瘤特性,其作用机制主要为抑制转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)抑制诱导的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程,未来胡椒碱将进一步运用于转移性肺癌和EMT等治疗中[20]。芝麻素通过降低肺癌细胞内线粒体离子肽酶1 (lon peptidase 1,mitochondrial,LONP1)水平,达到抑制细胞增殖和生长的目的,LONP1蛋白的减少可能会抑制肺癌的发生、发展[21]。荜茇酰胺可以促使细胞发生凋亡,抑制肺癌细胞的生长,同时也能抑制细胞集落和细胞迁移的过程[3,22]。

铁死亡是一种程序性细胞死亡,铁死亡具有促进和抑制肿瘤的双重作用[23]。本研究对铁死亡调控基因进行筛选并与荜茇和肺癌一起分析,得到 IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD 5个靶点。IL-6 在肺癌干细胞中能够促进细胞转移和增殖,在肿瘤的发生进展等过程中起着重要作用[24]。Han等[25]发现,IL-6可以降低支气管上皮BEAS-2B细胞活性,促进脂质过氧化,破坏BEAS-2B细胞的铁稳态并加快诱导铁死亡。有研究表明,NOX1(胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1)可能通过增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表达,引起A549细胞的凋亡,显著抑制肺癌细胞增殖的作用[26]。NOX1通过催化产生活性氧过程,阻止诱导ROS来抑制铁死亡过程[27]。NOX3(酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶3)属于NOX家族,NOX家族参与一种膜结合酶复合物,与其他蛋白质一起,可以通过质膜运输电子,产生超氧化物和其他下游ROS,由NOX家族介导的ROS生成可促进铁死亡的脂质过氧化[28]。李宏谦等[29]提出,NOX3可能通过增加细胞的迁移速率,达到侵袭肿瘤细胞的目的。有研究表明,PTGS2(前列腺素内过氧化物合酶2或环氧合酶2)参与铁死亡过程当中的脂质代谢,可调节细胞铁死亡过程,可能促进铁死亡[30-31]。Pan等[32]发现,环氧合酶抑制剂可以降低ELMO 3(吞噬和运动蛋白3)的表达,而ELMO 3抑制肺癌的生长和转移有关系。Talmadge等[33]发现,环氧合酶可以促进Lewis肺癌细胞的表达,环氧合酶抑制因子能够促进特异性 T 细胞反应,在免疫治疗学广泛应用。研究证明,G6PD在多种恶性肿瘤中均有表达,特别是与肺癌的临床研究相关,是肺癌预后的独立预测标志物[34]。有研究表明,G6PD可调节核糖-5-磷酸和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的生成,通过调节细胞内NADPH水平,调控铁死亡过程[35]。综上,5种核心基因都可以有效地参与铁死亡进程,同时与肺癌临床进程相关,所以靶向这些基因进行铁死亡治疗对于肺癌的治疗有着至关重要的作用。

目前,临床治疗肺癌多采用多方法综合治疗方案,中医药疗法作为其中一种治疗方案也越来越被认可。以中医理论方法为指导的温阳法治疗肺癌疗效显著。本文基于网络药理学分析荜茇治疗肺癌的网络关系,通过挖掘荜茇调控铁死亡治疗肺癌发挥作用的潜在靶标及相关通路,结果显示,荜茇治疗肺癌与铁死亡调控有相同基因,说明荜茇可以通过调控铁死亡途径发挥治疗肺癌的作用,为中医药治疗肺癌提供了新思路。