稀释与接种法测定五日生化需氧量的影响因素分析

张 丽

（山西省阳泉生态环境监测站，山西 阳泉 045000）

五日生化需氧量是在一定条件下，微生物分解水中某些可氧化的物质，特别是分解有机物的生物化学过程消耗的溶解氧量。在生态环境监测中，五日生化需氧量是水质有机污染综合指标之一，是国家地表水、国家采测分离、污水监测中一个重要的监测指标，所以提高测定五日生化需氧量的准确度和精密度有很重要的意义。在对污染的水体和工业废水等复杂水样监测时，因为有很多因素的影响，使稀释与接种法测定五日生化需氧量出现误差。为了提高测定五日生化需氧量的准确度，本文从水样的采样及保存、水温、pH、生化培养箱的温度、固定剂的加入顺序，稀释倍数的确定、接种液的选择等方面讨论，并给出解决方案。

1 测定原理

生化需氧量是指在规定的条件下，微生物分解水中可氧化的物质，特别是在分解水中有机物的过程中，发生的生物化学反应，消耗溶解氧。通常情况下，水样充满完全密闭的溶解氧瓶中，在20 ℃±1 ℃的暗处培养5 d±4 h，分别测定培养前后水样中溶解氧的质量浓度，由培养前后溶解氧的质量浓度差，计算每升样品中消耗的溶解氧量，以BOD5形式表示[1]。

目前，在标准HJ 505—2009 中，稀释与接种法测定五日生化需氧量有4 种方法：非稀释法、非稀释接种法、稀释法、稀释与接种法[1]。

2 研究方法

主要仪器：生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；虹吸管；250 mL 溶解氧瓶；25 mL 酸式滴定管；100 mL 量筒；

主要试剂：硫酸锰、碱性碘化钾-叠氮化钠、浓硫酸、重铬酸钾溶液、淀粉溶液、（1+5）硫酸、三氯化铁溶液、氯化钙溶液、磷酸盐溶液、硫酸镁溶液、0.01 mol/LNa2S2O3溶液。

测定方法：稀释与接种法测定五日生化需氧量。

3 方法影响因素

3.1 采样及保存

样品需要采集到1 000 mL 棕色瓶中，不能有气泡，不能采集到塑料瓶或其他玻璃器皿中。水样要溢出棕色瓶2 s 后，密封试样。试样中不能引入新的氧气。24 h 之内完成实验室分析测试。24 h 不能分析，冷冻保存，冷冻样品需提前解冻、均质化和接种。用稀释水做全程序实验空白，运送回实验室。全程序空白溶解氧质量浓度要小于0.5 mg/L，否则应查污染来源。

3.2 水温

水温和溶解氧是成反比的，水温低，溶解氧高；水温高，溶解氧低。水温要控制在20 ℃左右。冬天较清洁的水样中溶解氧往往是过饱和的，并且水温低，应该将水温升至20 ℃左右，充分振摇，并开塞放气，赶出饱和溶解氧后再测定。夏天水样水温高，使水样降温到20 ℃，充分振摇，使水样和空气中氧分压接近平衡[3]。

3.3 pH 值

大多数微生物在酸性和弱碱性溶液中更容易繁殖生长。用pH试纸对水样pH进行范围测定。水样pH要控制在6.5～7.5，用酸或碱调整到6.5～7.5。但酸或碱的加入量不能超过水样体积的0.5%。一般调节到水样pH=7.2。稀释水和接种稀释水的pH 也应该控制在7.2。

3.4 生化培养箱温度

生化培养箱温度要严格控制在20 ℃±1 ℃，每相差1 ℃，测定误差为5%左右。用连续温度记录仪掌握培养期间的温度。做实验之前，要提前4 h 把生化培养箱打开，设定好温度。水样用虹吸管分成2 份，一份在15 min 后测定溶解氧，一份放入生化培养箱5 d±4 h 后测定溶解氧。注意添加封口水，防止空气中氧进入溶解氧瓶。避光，防止试样中藻类产生溶解氧。从样品放入培养箱起计时，培养5 d±4 h 后测定。

3.5 固定剂加入顺序

测定过程中，先加硫酸锰，再加碱性碘化钾-叠氮化钠[2-3]。如果做样人员将硫酸锰和碱性碘化钾-叠氮化钠的顺序加反，则会造成测定的溶解氧不准确。

3.6 稀释水

对于某些地表水和大多数工业废水，因含有较多的有机物，需要稀释后再培养测定，以降低其浓度和保证有足够的溶解氧。为了保证水样稀释后，有足够的溶解氧，稀释水通常要通入空气或氧气进行曝气，使稀释水中溶解氧接近饱和。稀释水中需要加入三氯化铁溶液、氯化钙溶液、磷酸盐溶液、硫酸镁溶液，以保证微生物的生长。稀释水要控制温度为20 ℃，曝气至少1 h，溶解氧质量浓度达到8 mg/L 以上。曝气过程中，防止污染物进入水体中。稀释水的浓度不能过饱和，使用前需开盖1 h，在24 h 使用完毕。接种稀释水空白值要小于1.5，否则应检查污染源。

3.7 稀释倍数

遇见复杂的水样，用稀释法或接种稀释法测定五日生化需氧量是很重要的方法。有些水样有机物含量高，直接测定的话，五天培养后的水样加入硫酸锰和碱性碘化钾-叠氮化钠后，水样成白色絮状沉淀，说明水样中有机物含量高，此培养液剩余溶解氧为零，应加大稀释比。水样需要重新稀释，重新测定。

确定合理的稀释倍数是成功测定BOD5的关键之一，稀释的倍数一般以五日培养后消耗的溶解氧占原有溶解氧的40%～70%为宜。水样稀释后，应满足五天培养过程中，溶解氧消耗量不小于2 mg/L，五天后测定溶解氧不小于2 mg/L，两个条件同时满足，测定数据才准确。水样不稀释的话，要满足五天后测定溶解氧不小于2 mg/L 这个条件。以质控样200265（36.9±3.3）、200263（62.6±3.9）为例，探讨稀释倍数的确定，结果见表1。

表1 不同稀释倍数条件下质控样的测定结果

3.8 接种液

对于一般的地表水、污水厂出口的水不含或少含微生物的工业废水的测定，需要接种，引入微生物，创造有利于微生物生长的环境，以利于能分解废水中有机物的微生物。分别选择市污水厂进口的污水和工业废水为接种液，测定接种稀释空白。结果见表2。

表2 接种液选择测定结果

市污水厂进口为稀释接种空白，空白值小于1.5，满足需要，有利于微生物繁殖生长。以工业废水为稀释接种空白的话，空白值大于1.5，不满足要求，不利于微生物繁殖生长。所以选择接种液的时候，要选择城镇生活污水厂污水进口。

3.9 CODCr 和BOD5 的关系

水样中，测定CODCr时，采用的是强氧化剂，水样中可被氧化的有机物占到85%～95%，同一个水样中CODCr值＞BOD5值。

在做质控样的时候，选用环保部的三个标准样品和2021 年第一季度国家能力验证样品SMP 2021—7699 进行CODCr和BOD5的测定，结果见表3。SMP 2021—7699 通过国家能力验证，结果为满意。从表3可以看出，BOD5值=0.7×CODCr值。

表3 BOD5 测定值和CODCr 测定值相关性表

对于污染程度严重的水样，例如，生活污水、工业废水，CODCr值=（2.5/3.5）×BOD5值[5]。

3.10 干扰的消除

1）如果有亚硝酸盐干扰，可预先配置碱性碘化钾-叠氮化钠消除干扰。

2）如果水样中含氧化性物质（如游离氯等），可加入适量硫代硫酸钠消除干扰。

3）如果水样中含重金属等有毒物质时，可以提高稀释倍数减少有毒物质的浓度或者使用经过驯化的微生物接种液的稀释水进行稀释。

4 结语

稀释与接种法测定水样中BOD5为一种经验方法，该方法是利用微生物分解水中有机物过程中消耗溶解氧的量来测定的，所以该方法与微生物有密切关系，微生物生长繁殖又与环境因素息息相关。本文从水样的采集、保存、水温和pH 的控制、生化培养箱的温度、稀释水的影响、稀释倍数的确定、CODCr和BOD5的关系、干扰的消除方面探讨了稀释与接种法测定，并提出了相应的解决方法，具有很好的适用性和可操作性[5]。