空心莲子草ApCAT 基因家族鉴定和表达模式

韩晓文，韩 硕，胡义锋，王梦如，陈中义，朱永兴，尹军良

（1.长江大学湿地生态与农业利用教育部工程研究中心 / 长江大学农学院 / 长江大学园艺园林学院, 湖北 荆州 434025；2.中南民族大学生命科学学院, 湖北 武汉 430074）

空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)，也称水花生、空心苋，属多年生宿根草本植物，原产于南美洲，是一种“水陆两侵”的外来入侵物种[1]。目前，空心莲子草在20 余个省(市)均有分布，黄河以南的区域为害尤其严重，据2016 年统计，全国中度以上(盖度大于30%)危害面积超过500 万hm2，直接经济损失每年16 亿～18 亿元[2]，如何高效防治空心莲子草已成为国内外研究的热点之一。

植物受到生物/非生物胁迫时，其细胞内的氧化还原动态平衡被打破，导致过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH-)、超氧阴离子(O2-)等氧自由基(ROS)的过量产生[3-4]。适量的ROS 在生物体内可作为第二信使参与细胞信号转导，激活免疫细胞、引起细胞增殖、衰老和凋亡[5]，但ROS 的过度积累会导致植物细胞的氧化应激损伤[3]。其中过氧化氢酶(catalase, CAT)能够通过催化电子转移，将生物体内多余H2O2还原成H2O 和O2，有效清除植物光呼吸和线粒体电子传递过程中产生的过氧化氢[6]。CAT 的相对分子质量在200～400 kDa，通常由4 个亚基组成[7]。每个亚基在羧基端含有1 个血红素分子和1 个CAT 体靶向信号肽(PTS1)序列[8]。根据CAT催化中心结构的不同，CAT 可分为铁卟啉结构CAT(FeCAT)和锰卟啉结构CAT (MnCAT) 。

大量研究表明，CATs基因具有时空表达特异性，例如玉米(Zeamays)ZmCAT1和ZmCAT3在籽粒发育整个过程均有表达，ZmCAT2仅在籽粒发育后期表达[9-10]。水稻(Oryzasativa)OsCATA和OsCATC的表达受昼夜节律调控，OsCATA在晚上特异性表达，OsCATC在清晨特异性表达[11]。同时CATs基因在胁迫应答响应过程中发挥重要作用[12]。拟南芥(Arabidopsisthaliana) AtCAT1 通过降解H2O2来响应非生物胁迫，此外，AtCAT2 和AtCAT3 可以降解H2O2来维持细胞内ROS 的动态平衡[13]；过表达OsCATA和OsCATC提高了水稻的抗旱性，同时OsCATC 也可以被STRK1 磷酸化激活，从而提高水稻的耐盐性和抗氧化性[11]；ZmCAT2转基因烟草(Nocetoana tabacum)与野生型相比具有更强抗病性和活性氧胁迫的耐受性[14]。此外，CAT 在植物响应除草剂胁迫中发挥重要作用，例如不同浓度的乙草胺和阿特拉津均能使肉芝软珊瑚和短指软珊瑚CAT 酶活性快速上升，且在一定范围内，CAT 酶活性随着除草剂浓度升高和胁迫时间延长而持续上升[15]。不同浓度的噻隆·异噁酮施药7、14 d 时玉米CAT 酶活性显著提高，且活性随着施药时间的延长和药剂浓度的降低而逐渐降低[16]。

到目前为止，CAT基因家族已在小麦(Triticum aestivum)[5]、水稻[11]、油菜(Brassicanapus)[17]等多种植物中进行了鉴定分析，并对其胁迫响应模式进行了研究，但尚缺乏对空心莲子草CAT 家族成员的系统认识。因此，本研究对空心莲子草的CAT基因进行系统鉴定，并分析了该基因家族成员在除草剂胁迫下的表达模式，旨在了解CAT 在空心莲子草胁迫应答响应过程中的潜在作用，为空心莲子草的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 空心莲子草ApCAT 的鉴定

获取空心莲子草基因组数据库[18]。从Pfam(http://pfam.xfam.org/)下载CAT (PF00199)的隐马尔可夫模型序列，BLASTp 搜索空心莲子草氨基酸序列数据库，鉴定候选ApCAT (e-value ＜ 1e-10)[19]。获得的候选序列通过Pfam (v35.0，http://Pfam.xfam.org)和 InterProScan (v93.0， http://www.ebi.ac.uk/InterPro Scan)进行确认，排除不包含CAT 结构域的序列。

1.2 ApCAT 系统发育分析

使用ClustalW2 软件将ApCAT 与已知物种(水稻、拟南芥) CAT 氨基酸序列进行多序列比对。使用ITOL 工 具(Interactive tree of Life， http://ITOL.embl.de)绘制包含ApCATs、AtCATs 和OsCATs 的系统发育树，说明ApCATs 的系统发育关系，并辅助它们的命名[20]。

1.3 ApCAT 保守结构域和基序分析

根据GFF3 基因结构注释信息，利用TBtools 绘制ApCATs 的外显子/内含子结构图。使用MEME(版 本 5.5.1， http://meme-suite.org/tools/meme)识 别ApCATs 的保守基序[21]。参数设置如下：每个序列可以包含任意个的非重叠基序，不同基序的数量为10，基序宽度范围为6 到50 个氨基酸。利用TBtools绘制蛋白基序结构图。

1.4 ApCAT 蛋白质特征分析

使用ExPASyServer10 (https://prosite.expasy.org/PS 50011)分析ApCATs 的蛋白质基本特征，包括蛋白序列长度(Len)、分子量(MW)、等电点(pI)、总亲水性(GRAVY)[22]。使用Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Plant multi)预测ApCATs 的亚细胞定位[23]。使用SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/)对ApCATs 的三维结构进行同源建模。

1.5 ApCATs 表达模式分析

从NCBI 的SRA 数据库收集4 组空心莲子草的转录组测序数据[24]。详情信息：PRJNA256235，陆地和池塘中采集的混合组织样本；PRJNA256237，低钾胁迫下根部组织样本；PRJNA263573，水中和盆栽种植的茎节组织样本；PRJNA268359，山东济南收集的“北方”种群和上海收集的“中央”种群上部第1～3 对叶片组织样本。通过Cufflinks 计算ApCATs基因的表达水平(用标准化的FPKM 值表示)。使用log2(FPKM + 1)值，通过R 软件包pheatmap 绘制热图，展示不同条件下ApCATs基因的表达模式[25]。

1.6 除草剂防效测试

试验于10 月中旬在长江大学农学院实验田中进行，选取平均高度为10～15 cm、长势一致的空心莲子草植株，每次处理重复3 次，共18 个小区，小区面积1 m2，每个处理喷施药液量为250 mL，重复3 次，空白对照为清水。分别于0.5、1、3、5、7 d 观察防治效果并取样。供试药剂及浓度如表1 所列。

表1 试验药剂和浓度Table 1 Data for the agents and their concentrations

1.7 RT-qPCR 分析

除草剂处理0.5、1、3、5、7 d 时分别收集顶端嫩叶，-80 ℃保存。使用TRizol 试剂(GenStar，中国北京)提取总RNA，并用DNaseI (TaKaRa，中国大连)去除DNA。使用RevertAid 逆转录酶(Vazyme，中国南京)将RNA 逆转录为cDNA。然后将cDNA稀释至100 ng·μL-1。按照制造商的说明书，使用SYBR GreenMaster Mix (Vazyme，南京，中国)在CFX96 实时PCR 系统(BioRad，HercuLes，CA，USA)上进行RT-qPCR。使用PrimerPremier5 软件设计基因特异性引物。20 μL RT-qPCR 反应体系由10 μL 2 × SYBR Premix Extaq、正向和反向引物各0.4 μL、cDNA 2 μL 和7.2 μL ddH2O 组成。试验流程如下：95℃预变性30 s (步骤1)；95 ℃变性5 s (步骤2)，58℃退火15s，72 ℃延伸30 s，60 ℃荧光信号采集30 s(步骤3)；步骤2 至步骤3 循环40 次。

1.8 统计分析

使用2-ΔΔCt方法计算ApCAT基因的相对表达水平[5]，运用Excel 2016 对数据进行整理分析，使用单因素方差分析来计算平均值之间的显著差异，本研究差异显著水平均为P＜ 0.05。

2 结果与分析

2.1 ApCAT 的鉴定及系统发育分析

为鉴定空心莲子草基因组中的ApCAT基因，以CAT (PF00199)种子序列作为参考序列进行本地BLASTp，并利用Pfam 验证候选序列中是否含有CAT 结构域。最终从空心莲子草基因组中鉴定到20 个ApCAT基因(图1)。根据系统发育树所示的进化关系，将它们分别命名为ApCAT1到ApCAT20。根据系统发育树的聚类情况，将ApCAT基因家族分为3 个亚群(Group a、b、c)。

图1 空心莲子草、拟南芥和水稻CAT 成员的系统发育分析Figure 1 Phylogenetic analyses of catalase (CAT) from Alternanthera philoxeroides, Arabidopsis thaliana,and Oryza sativa

2.2 ApCATs 蛋白基序和基因结构

根据GFF3 基因结构注释信息，使用TBtools 绘制ApCATs的外显子/内含子结构图，并根据系统发育树的顺序排列(图2A)。所有ApCATs均不含内含子，其中ApCAT7.a、ApCAT17.b和ApCAT16.b仅在5’端包含UTR 区域；ApCAT2.c、ApCAT8.c、ApCAT15.c、ApCAT9.c和ApCAT1.c仅在3’端包含UTR 区域；而ApCAT13.b和ApCAT19.c在两端均含有UTR 区域(图2B)。保守基序分析发现，从ApCATs 中鉴定到10 个motif，其中ApCATs3.c 含有的motif 最少，为2 个；ApCATs13.b 含有的motif 最多，为11 个；结合系统发育分析发现，亲缘关系越近的ApCATs 含有越相似的motif (图2A、B)。结构域分析发现，motif 1 到motif 4 和motif 7到motif 9 均为氧化氢酶核心结构域(catalase domain)，motif 5 为过氧化氢酶相关的免疫应答结构域(catalase-related immune-responsive domain)。其他motif 未匹配到已知的关键功能结构域(图3)。

图2 ApCATs 系统发育树(A)、ApCATs 基因结构(B)、ApCATs 蛋白motif 分布(C)Figure 2 Phylogenetic tree of ApCATs (A), gene structure of ApCATs (B) , and motif distribution of ApCATs (C)

图3 ApCATs 保守基序Figure 3 Conservative motif in ApCATs

2.3 ApCATs 蛋白特征和三维结构

蛋白质特性分析发现，ApCATs 氨基酸数量平均值为194 aa，分布范围为74～492 aa，分子量平均值为22.32 kDa，分布范围为8.51～57.05 kDa。等电点平均值为7.39，分布范围为4.26～9.69，平均值小于8，故大部分ApCATs 为酸性蛋白质。不稳定指数平均值为32.52，分布范围为13.72～49.10，除ApCAT1.c、 ApCAT3.c、 ApCAT9.c、 ApCAT13.b、ApCAT15.c、ApCAT19.c、ApCAT20.c 外，其他ApCATs属于稳定蛋白质。亲水性平均值-0.55，分布范围为-1.17～-0.05，所有亲水性的数值小于0，说明ApCATs 都是亲水性蛋白质。亚细胞定位预测分析发现，所有ApCATs 均分布在过氧化物酶体中，同时部分ApCATs 也预测可能分布在线粒体、叶绿体和细胞核内(表2)。

表2 ApCATs 蛋白质特征分析Table 2 Characterization of Alternanthera philoxeroides ApCAT proteins

通过SWISS-MODEL 完成了ApCATs 的三维同源性建模(图4)，所有的ApCATs 主要由α-螺旋、β-转角、延伸链和随机卷曲构成，而这4 种结构在ApCATs 蛋白中的比例不同，随机卷曲所占比例最大(23.71～51.14%)，其次是α-螺旋(14.58%～37.11%)和延伸链(9.60%～33.98%)，β-转角所占比例最小(5.75%～19.42%)。

图4 使用SWISS-MODEL 生成的ApCATs 的3D 模型预测Figure 4 Predicted three-dimensional models of ApCATs generated by using SWISS-MODEL

2.4 ApCATs 的表达模式分析

ApCAT1.c、ApCAT2.c、ApCAT3.c、ApCAT12.b、ApCAT14.b、ApCAT16.b、ApCAT17.b、ApCAT18.b和ApCAT19.c在不同处理下的表达水平普遍较高，而其他ApCATs表达水平偏低或不表达。在水中和盆栽种植的茎节组织样本中，ApCAT14.b、ApCAT18.b、ApCAT17.b、ApCAT3.c和ApCAT19.c的 表 达 量 先 上升，在12 h 时达到峰值后下降；而ApCAT16.b的表达量先下降，在12 h 降到最低后回升。此外，根系组织在低钾胁迫下，ApCAT6.a、ApCAT14.b、ApCAT17.b、ApCAT18.b和ApCAT19.c的 表 达 量 下 降，ApCAT4.a和ApCAT12.b的表达量上升。对于空心莲子草的不同种群，除了ApCAT14.b在山东济南收集的“北方”种群中的表达量高于上海收集的“中央”种群外，其余ApCATs在两个种群中的表达水平相差不大(图5)。

图5 不同组织和处理的ApCATs 表达热图Figure 5 Heat map of ApCATs in different tissues and under different treatments

2.5 除草剂对空心莲子草的防治效果

5 种除草剂对空心莲子草的防治效果不同。20%氯氟吡氧乙酸和13%噁草酮防治效果最好，20%氯氟吡氧乙酸在药后5 d 时引起植株退绿、萎蔫，停止生长，而13%噁草酮在药后3 d 时引起顶端幼嫩组织坏死；其次是10%乙羧氟草醚和41%草甘膦，在药后5～7 d 时引起顶端幼嫩组织失绿枯黄，并且41%草甘膦在药后7 d 时开始出现褐色枯斑；50%异丙隆防治效果不明显，药后7 d 后均无明显变化(图6)。

图6 5 种除草剂药对空心莲子草的生长的影响Figure 6 Influence of five herbicides on Alternanthera philoxeroides growth

2.6 ApCATs 的除草剂诱导表达模式分析

挑选6 个高水平表达的ApCATs 基因，利用RTqPCR 检测其在5 种农药处理下的相对表达量(图7)。ApCATs 对5 种农药处理均有响应。

图7 5 种除草剂不同处理时间下ApCATs 的相对表达量Figure 7 Expression patterns of ApCATs in the presence of the five herbicides

在氯氟吡氧乙酸处理下，2 个ApCATs的表达量呈下降趋势，4 个ApCATs的表达量呈先升高后降低的趋势，但5 d 时6 个ApCATs表达量显著升高，其中ApCAT12.b的表达量升高最显著，是CK 的5.5倍。此外，6 个ApCATs在3 d 时表达量均降低，其中ApCAT17.b最显著，仅为CK 的9% (图7A)。

在 噁 草 酮 处 理 下，ApCAT3.c、ApCAT12.b和ApCAT14.b在3～7 d 时有明显的下降趋势，ApCAT16.b、ApCAT17.b和ApCAT18.b在1～5 d 时有明显的上升趋势。此外，在1 和7 d 时6 个ApCATs的表达量均下降，其中ApCAT18的表达量最低，分别只有CK 的0.3%和0.2% (图7B)。

在乙羧氟草醚处理下，5 个ApCATs 呈先升高后下降再升高的趋势，4 个ApCATs 在3 d 时表达量显著降低，其中ApCAT14.b的表达量最低，仅为CK 的0.8%，而ApCAT17.b在1 d 时表达量最低，为CK 的19%。此外ApCAT18.b在0.5 d 时表达量升高最显著，是CK 的1.9 倍，随后在1 d 时下降并稳定在CK 的78%～94%(图7C)。

草甘膦处理下，6 个ApCATs基因的相对表达量呈下降趋势(图7A)，其中ApCAT14.b、ApCAT17.b和ApCAT18.b表达量降低最为明显，分别下降至CK 的19%、9%和17%。ApCAT3.c和ApCAT12.b，在3 和7 d 时表达量高于CK，最高达到1.5 倍。(图7D)。

异丙隆处理下，处理1 d 时，ApCAT12.b表达量与CK 相比上升3.1 倍，其余5 个ApCATs均低于CK，其中ApCAT18最低，仅为CK 的0.4%。此外ApCAT12在0～7 d 时表达量均较高，是CK 的1.7～4.2 倍，而ApCAT14.b、ApCAT16.b和ApCAT18.b表达量持续下降，尤其是ApCAT16.b在处理1 d 后均不足CK 的15% (图7E)。

3 讨论

空心莲子草在2003 年被列入“中国第一批外来入侵物种名单”，具有极强表型可塑性和入侵性，对我国生态系统和社会经济造成恶劣的影响。已有研究表明CAT 在空心莲子草响应锌、铜等重金属胁迫[26-28]和涝渍胁迫[29]中发挥调控作用。同时，CAT在植物响应除草剂中发挥重要作用[30-33]，而CAT 在空心莲子草响应除草剂中的作用尚未研究。因此，开展基因组水平空心莲子草ApCATs基因的系统鉴定和分析，了解其表达模式，尤其揭示其响应除草剂的诱导表达特征，可为开展ApCATs逆境胁迫响应功能研究奠定基础，也为空心莲子草的有效防治提供指导。

本研究从空心莲子草全基因组中鉴定了20 个ApCAT基因家族成员(ApCAT1～ApCAT20)，其成员数量高于拟南芥(3 个)[13]、水稻(3 个)[11]、小麦(10 个)[5]和甘蓝型油菜(14 个)[17]。其中ApCAT编码的蛋白质长度为74～492 aa (表2)，其蛋白长度差异较大且相对于其他物种来说长度较短，例如在油菜 中[17]，BnCATs 长 度 为477 (BnCAT13)～1 040 aa(BnCAT10)； 在 小 麦 中[5]， TaCATs 长 度 为 290(TaCAT3-A2)～494 aa (TaCAT2-A)；而水稻[11]和大豆[34]中，所有的CAT 长度均为492 aa。通过保守基序分析发现，ApCAT基因含有10 个motif，其中motif1 到motif5、motif7 到motif9 均注释为过氧化氢酶功能结构域。此外结合系统发育分析发现，处于同一亚组的ApCAT 含有越相似的基因结构和motif，但个别家族成员的motif 数量存在一定的差别，推测该现象是因为ApCAT 在进化过程中丢失或新增Motif 所致[35]。

为了解ApCATs基因的表达水平，借助已经发表的RNA-seq 数据，对20 个空心莲子草CAT基因表达水平和表达模式进行了初步分析，并揭示了在不同环境条件下的ApCATs 表达水平(图6)。本研究表明，ApCATs的表达具有时空特异性。ApCAT14.b、ApCAT18.b、ApCAT17.b、ApCAT16.b、ApCAT12.b、ApCAT3.c、ApCAT2.c、ApCAT19.c和ApCAT1.c在 不同处理下(低钾胁迫、水分变化)的表达水平普遍较高，并且在不同的水分环境中总体表达量变化趋势相似。因此推测不同的水分环境的变化对ApCAT基因的表达影响较小。此外，在山东济南收集的“北方”种群和上海收集的“中央”种群中除ApCAT14.b的表达量在叶片差异较大外，其余ApCATs的表达水平相差不大。这表明，在正常生长的情况下，空心莲子草ApCAT的表达量受纬度、海拔、温度、光照等条件的影响较小，推测ApCATs的表达可能受到特定环境条件的诱导，例如干旱[36]、盐[37]、低温[38]等胁迫。

为了研究除草剂诱导ApCAT的表达特征，本研究对6 个高水平表达的ApCATs在5 种除草剂胁迫下的表达模式进行了系统分析。结果发现，20%氯氟吡氧乙酸药后5 d 时植株开始出现失绿、黄花的症状；药后7 d 时植株已经完全枯黄萎蔫，停止生长。与本研究结果类似，高宗军等[39]的研究表明，20%氯氟吡氧乙酸(100 g·hm-2, 有效成份)会使空心莲子草叶片紫化、萎蔫，并在10 d 时引起植株死亡。同时，表达模式分析发现ApCAT3.c、ApCAT12.b和ApCAT16.b在5～7 d 时的表达量均显著高于CK。而在水稻中，各浓度下氯氟吡氧乙酸在6 d 时能够引起水稻根系和叶片组织中活性氧的积累，同时积累程度随着浓度的增加而升高；且低浓度的氯氟吡氧乙酸(0.1 mg·L-1)显著增加了CAT 酶活性和CAT同工酶的表达量[32]。因此推测在空心莲子草中，氯氟吡氧乙酸可能同样导致植物体内活性氧的积累，从而诱导CAT基因的表达。

在噁草酮处理中，3 d 时出现了顶叶白化的现象。类似的，在高宗军等[39]的研究中，13%噁草酮(400 g·hm-2)药后空心莲子草叶片白化、干卷，并在3 d 时死亡。同时，水稻植株噁草酮(1 270 g·hm-2)药后6 d，CAT 酶活性增加了22%，CAT 同工酶的表达量也显著增强[31]。本研究中，ApCAT12.b和ApCAT18.b的表达量在5 d 时显著高于CK，而其余4 个ApCATs在6 d 左右时的表达量并未高于CK，并且所有ApCATs的表达量在7 d 时均显著降低，其原因未知，需要进一步的研究。

在乙羧氟草醚处理中，10%乙羧氟草醚药后7 d 时也引起心叶枯黄，而相关研究表明，20%乙羧氟草醚(80 g·hm-2)在药后5 d 时会引起空心莲子草心叶卷曲枯黄[39]，这一差异可能是由于药剂浓度不同而导致的。表达模式分析结果表明，ApCAT3.c、ApCAT12.b、ApCAT16.b和ApCAT18.b在 施 药1 d 内表达水平显著升高，推测这4 个ApCATs在药后短时间内受到乙羧氟草醚的诱导。

在草甘膦的处理中，空心莲子草在41%草甘膦药后7 d 时出现轻微枯黄并开始出现枯斑。而高宗军等[39]研究表明，41%草甘膦(800 g·hm-2)在药后4 d 时引起空心莲子草叶片枯黄并有枯斑，与本研究结果存在一定的差异，推测原因可能是喷施方式和施药剂量不同。在玉米[40]、莎草(Cyperus rotundus)[41]和大豆(Glycine max)[42]等植物中，草甘膦药后3 d会引起植株体内CAT 酶活降低。而类似的，在本研究中ApCAT14.b、ApCAT16.b、ApCAT17.b和ApCAT18.b的表达量在药后7 d 内均较低，推测草甘膦可以通过抑制CAT基因的表达，从而降低CAT 酶活性。

在异丙隆处理中，空心莲子草在50%异丙隆处理7 d 内均无任何变化，而相关研究表明，异丙隆一种持效型除草剂，在药后10 d 后才会引起空心莲子草植株死亡[39]。结合表达分析发现，ApCAT3.c、ApCAT12.b和ApCAT18.b的表达量在0.5 d 时显著升高，并且ApCAT12.b在0.5 d 后继续升高，在3 d 时达到峰值，而ApCAT17.b在处理7 d 时显著升高并达到峰值。因此推测ApCAT12.b在处理前期受异丙隆的诱导，ApCAT17.b在处理后期受到诱导。

4 结论

本研究共鉴定出20 个ApCATs基因。所有的ApCATs 均只含有一个CAT 结构域，且均为亲水性蛋白；所有ApCATs 均预测定位于过氧化物酶体，个别ApCATs 也有定位线粒体、叶绿体和细胞核的可能。ApCAT成员受纬度、海拔、温度、光照、水分条件等影响较小，表达水平相对稳定，但响应除草剂胁迫而诱导差异表达。20%氯氟吡氧乙酸和13%噁草酮防治效果好，结合RT-qPCR 分析结果表明，ApCAT 家族成员在空心莲子草响应除草剂处理过程中显著差异表达，参与对除草剂胁迫的应答过程。