藜麦松露饮料酒发酵过程中感官、理化指标变化及挥发性风味成分分析

胡海洋，肖 宇，2，伍一有，戴 雅，邓金鹏，胡一晨，2，邓 杰，3，李 翔，2*

（1.成都大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610106；2.农业农村部杂粮加工重点实验室，四川 成都 610106；3.汉源县市场监管局，四川 雅安 625300）

藜麦（Chenopodium quinoaWilld.）是藜科藜属植物，原产于南美洲的哥伦比亚、厄瓜多尔和秘鲁的中高海拔山脉，对干旱、寒冷和盐环境有一定的耐受性，在世界范围内广泛种植[1-2]。其作为一种全谷物，具有很高的营养价值，有助于克服无麸质产品的一些营养缺陷[3]。藜麦的成熟种子主要由11S型球蛋白（约占总蛋白质的37%）和2S型白蛋白（约占种子蛋白质的35%）组成[4]，含有更多的活性成分（如酚类、类黄酮和皂苷）[5-6]，其果糖和葡萄糖含量较低，对糖脂代谢起到有益作用[3]。藜麦也是膳食纤维、维生素和矿物质的来源，与其他谷物相比，藜麦种子提供所有必需氨基酸[5]。联合国粮农组织将藜麦确定为唯一一种在单一作物中满足人类所有营养需求的谷物[7]。除了上述丰富的营养成分外，藜麦还可显著预防多种疾病，尤其是癌症、过敏和炎症性疾病，并可能降低心血管疾病带来的风险[2]。

松露是一种稀有且昂贵的药用蘑菇，被誉为餐桌上的“黑钻石”[8]。欧洲人将其与鱼子酱、鹅肝一起列为“世界上最珍贵的三大美食”[9]。由于松露的蛋白质含量高（20～27 g/100 g干质量），富含粗纤维、脂类和碳水化合物，因此松露长期以来一直被用作肉类替代品，如在肉类稀少的阿拉伯半岛，松露可以与大米一起油炸和烹饪[10]。ENSHASY H E等[11]研究表明，松露的生物活性成分包括花青素、类黄酮、糖、类胡萝卜素、甾醇和挥发性物质。松露还具有抗抑郁、壮阳、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肝毒性、抗病毒和抗突变等多种健康益处[12-13]。KHALIFA S A M等[12]研究表明，松露在民间医学中可用于治疗类风湿性关节炎、疲劳、呕吐、受伤、呼吸问题和眼病。

糯米是中国最常见的谷物之一，含有多种营养素，包括蛋白质、碳水化合物、脂类、矿物质和维生素。具有滋补脾胃虚弱、气血两虚的作用[14]。糯米中含有大量普鲁兰多糖，分子排列较直链淀粉松散，吸水能力较强；烹饪后，其糊状物含有大量水分，有利于微生物的生长[15]。由于糯米中含有低聚糖、氨基酸等有机小分子的降解，由糯米制成的米酒，出汁率高，酒精度低，口感柔和，含有多种人体必需的生物短肽和维生素，使糯米酒充满酸甜浓郁的味道[16-17]，深受消费者喜爱。

近年许多研究使用藜麦来开发新的功能性食品，如烘焙产品、高蛋白肉类、乳制品以及利用藜麦和玉米粉制作有附加营养价值的挤压零食[18]。在发展中国家促进这种健康食品的生产和消费很重要[19]，近年其生产、贸易和消费都有了大幅增长。在粗面粉中添加藜麦可改善面食的营养特性，提高蛋白质的消化率和质量，从而获得较高的营养分数、较低的预测血糖指数、抗氧化能力和较高的营养价值[20]。即使没有外源酶，直接使用30%的未发芽藜麦代替大麦麦芽，也会对啤酒的整体感官质量产生积极影响[21]。通过向藜麦中添加燕麦β-葡聚糖来生产新的植物乳，从而改善了藜麦乳的功能、流变学和微观结构特性以及感官可接受性[22]；添加30%藜麦粉的扁平面包比对照面包的蛋白质含量高66.40%，可用于预防和治疗贫血和营养不良问题[23]。发酵酒饮料历史悠久，因其具有高营养价值、独特口味和高健康价值而被公众所喜爱[24]。本试验研究了藜麦松露饮料酒发酵过程中感官、理化指标的动态变化，并分析了其挥发性风味成分，以期为藜麦高值化与精准营养化生产等精深加工关键技术、以及多维品质评价技术奠定基础[25]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藜麦松露饮料酒（分别发酵0 h（对照）、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）：本实验室按照参考文献[26-27]的方法制备。

氢氧化钠（分析纯）：成都市科龙化工试剂有限公司；酚酞（分析纯）：杭州大阳化工有限公司；体积分数95%乙醇：天津科密欧化学试剂有限公司；齐墩果酸标准品（分析纯）：成都悦苍贸易有限公司；没食子酸标准溶液（纯度＞98%）：上海远跃生物技术有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）/G250染液（生化试剂）：上海酶联生物有限公司。

1.2 仪器与设备

DDS-11A型pH计：上海电子科学仪器有限公司；1260型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、7890B-5977B型气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：美国安捷伦有限公司；MK3型酶标仪：北京生物科技有限公司；UV-5200型紫外分光光度计：上海元分析仪器有限公司；HX-1800型全自动氨基酸分析仪：武汉恒信世纪科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 感官评价

由10名食品专业人员和感官敏感人员组成感官评分小组，根据GB/T 12312—2012《感官分析味觉敏感度的测定方法》[28]从颜色、气味、滋味三个方面对藜麦松露饮料酒进行感官评价，满分为100分。藜麦松露饮料酒感官评价标准见表1。

表1 藜麦松露饮料酒感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standards of quinoa truffle alcoholic beverage

1.3.2 pH值和酒精度测定

pH值测定：选择搅拌均匀的样品10 g，加入100 mL蒸馏水摇动后发泡15 min过滤，pH计直接测定滤液的pH值。

酒精度的测定：参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》[29]。

1.3.3 氨基酸态氮、可溶性蛋白质、还原糖含量测定

氨基酸态氮含量测定：采用GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》[30]中的甲醛滴定法。

可溶性蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝法测定。按照梯度稀释制备质量浓度分别为0、0.13 mg/mL、0.25 mg/mL、0.75 mg/mL、1.00 mg/mL、1.50 mg/mL的标准牛血清白蛋白（BSA）溶液，取5 μL添加至96孔板中（平行组5个），各孔再加入BSA/G250 染色液250 μL。将96孔板放入酶标仪，在波长570 nm处测量吸光度值。以BSA质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=0.448 3x+0.461 5，R2=0.994 1。将样品用超纯水稀释10倍稀释，与标准曲线相同的方法测定吸光度值，根据标准曲线方程计算出样品的可溶性蛋白质含量。

采用GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》中的直接滴定法[31]测定去除蛋白质后的样品中还原糖含量；参考GB 5009.8—2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》中的高效液相色谱法[32]测定葡萄糖和麦芽糖还原糖成分。

1.3.4 生物活性成分的检测

皂苷的测定：采用香草醛-高氯酸比色法测定[26]，使用齐墩果酸标准溶液测定标准曲线，得到齐墩果酸标准曲线回归方程：y=1.299x+0.039，R2=0.990 6。

多酚的测定：采用Folin-Ciocalteu比色法测定多酚含量，以没食子酸标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，建立没食子酸标准曲线，得到没食子酸标准曲线回归方程：y=0.004 6x+0.051 4，R2=0.993 6。

总黄酮的测定：采用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定[26]，以芦丁标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到芦丁标准曲线回归方程：y=35.192x+0.007 8，R2=0.996 6。

1.3.5 有机酸含量测定

参照GB 5009.157—2016《食品中有机酸含量测定方法》[33]制备流动相：吸取1 mL磷酸，超纯水定容至1 L容量瓶中，配成0.1 mol/L磷酸溶液。

制备标准溶液：称取草酸、酒石酸、乙酸、苹果酸、乳酸和柠檬酸标准样品20 mg，用0.1 mol/L磷酸配制成质量浓度为20 mg/mL的标准溶液。分别吸取以上6种标准溶液0.25 mL、0.125 mL、0.5 mL、0.25 mL、0.25 mL和0.25 mL至5 mL容量瓶，再用0.1 mol/L磷酸定容配制成混合标准溶液（草酸1.0 mg/mL，酒石酸0.5 mg/mL，乙酸2.0 mg/mL，苹果酸1.0 mg/mL，乳酸1.0 mg/mL，柠檬酸1.0 mg/mL）。再以0.1 mol/L磷酸将混合标准液分别稀释2、3、4、5和10倍。分别取样1 mL标准溶液用0.45 μm滤膜过滤制作标准曲线。

样品处理：取1.0 g发酵固液混合物用0.1 mol/L磷酸定容至10 mL，50 Hz超声10 min，12 000 r/min离心分离5 min，取上清液1 mL用0.45 μm滤膜过滤。

HPLC色谱条件：SELECT-HSS T3柱（250×4.6 mm，5 μm）流动相A为0.1 mol/L H3PO4，流动相B为CH3OH，梯度洗脱程序：0～13 min，2.5%B；13 min，80%B；13～20 min，2.5%B。紫外检测波长210 nm，进样量20 μL，流速1.0 mL/min。

定性定量方法：在相同的色谱条件下取6种有机酸标准溶液进样，确定6种标液的保留时间（retention time，RT），进行定性分析。注入不同浓度的混合标液，以混合标液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，通过标准回归方程进行定量分析，见表2。

表2 有机酸标准曲线回归方程Table 2 Standard curve regression equation of organic acids

1.3.6 氨基酸含量测定

采用全自动氨基酸分析仪测定。

1.3.7 挥发性风味成分分析

测定方法参考文献[26，34]：采用7890B-5977B型GC-MS联用仪，将样品置于萃取瓶放入仪器，采用75 μm的Car/PDMS萃取头，70℃平衡40min，解吸2min。GC条件：HP-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱，升温程序为50 ℃保持2 min，再以4 ℃/min升温160 ℃，再以8 ℃/min升温至280 ℃保持10 min。MS条件：电子电离（electronionization，EI）源，电子能量70 eV，温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描范围：20～450 amu。

定性、定量分析方法：采用RT对比的方法结合美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14 标准谱库检索比对结果进行挥发性化合物定性分析。采用峰面积归一化法定量。

1.3.8 关键挥发性风味物质分析及香气特征评价

利用相对气味活度值（relativeodoractivityvalue，ROAV）对各风味成分风味的贡献进行评价，贡献程度最大的物质定义为ROAVs=100，根据下式计算其他成分的ROVA值：

式中：ROAVi为样品中某成分的相对气味活度值，Ci为某风味成分的相对含量，%；Cstan为风味贡献最大的物质成分的相对含量，%；Ti为某风味成分的气味阈值，μg/kg；Tstan为风味贡献最大的物质成分的气味阈值，μg/kg。

根据ROVA的大小判断某风味成分对样品风味贡献大小，1≤ROAV≤100，表示对样品风味贡献显著且为关键风味物质；0.1≤ROAV＜1，表示对样品的风味起修饰作用[35]。通过嗅觉来对松露的香气特征进行定量数据分析（quantitative data analysis，QDA），最终获得评价结果。

1.3.9 数据分析

采用Excel 2016对数据进行初步整理，利用Origin 2021进行稳定性实验数据和风味数据雷达图的绘制。

2 结果与分析

2.1 藜麦松露饮料酒发酵过程中感官评分变化

由图1可知，藜麦松露饮料酒的感官评分随着发酵时间的增加呈先升高后降低的趋势，发酵48 h时达到最高，为87.4分；可能是因为以藜麦为主要底物生产时具有藜麦发酵的特征香气，同时具有强烈而和谐的酒精香气。随着发酵时间继续延长，藜麦松露饮料酒的感官评分降低，可能是因为糖类成分增加，滋味氨基酸含量降低，导致滋味物质浓度降低的结果。因此，该饮料酒的感官评分在发酵48 h达到最佳。

图1 藜麦松露饮料酒发酵过程中的感官评分变化Fig.1 Changes of sensory score of quinoa truffle alcoholic beverage during fermentation

2.2 藜麦松露饮料酒发酵过程中pH值和酒精度的变化

由图2可知，藜麦松露饮料酒的pH值随着发酵时间的延长呈先降低后趋于平稳的趋势，发酵48 h后，pH值的变化趋于平稳。发酵过程中不断产生的大量有机酸是饮料酒pH值持续下降的原因之一[36]，同时可能因为生成了更多的其他营养物质，导致有机酸浓度降低，因此pH值趋于平缓。藜麦松露饮料酒的酒精度随着发酵时间的延长呈持续升高的趋势，发酵时间为48 h时，藜麦松露饮料酒的酒精度为0.78%vol；发酵时间为60 h时，酒精度为1.15%vol。结合感官评分结果，发酵时间为48 h较适宜。

图2 藜麦松露饮料酒发酵过程中pH值和酒精度的变化Fig.2 Changes of pH and alcohol content of quinoa truffle alcoholic beverage during fermentation

2.3 藜麦松露饮料酒发酵过程中氨基酸态氮和可溶性蛋白质含量的变化

由图3可知，发酵过程中样品可溶性蛋白质和氨基酸态氮的变化总体趋势是先增加后减少；可溶性蛋白质含量和氨基酸态氮在48 h分别达到最大值6.64 g/100 g和31.50 mg/100 g。在发酵过程中，样品中的蛋白质被分解成小分子量的肽和蛋白质，增加蛋白质溶解度，获得所需的小分子氮源，因此可溶性蛋白质含量增加。进一步延长发酵时间，微生物不断通过相应的蛋白酶降解底物中的大分子蛋白质满足其生长繁殖条件，导致后期可溶性蛋白质呈下降趋势，而且产生更多的游离氨基酸，提高饮料酒的营养特性和风味[37]。

图3 藜麦松露饮料酒发酵过程中氨基酸态氮和可溶性蛋白质含量的变化Fig.3 Changes in amino acid nitrogen and soluble protein contents of quinoa truffle alcoholic beverage during fermentation

2.4 藜麦松露饮料酒发酵过程中生物活性成分含量的变化

由图4可知，在发酵过程中，饮料酒中的皂苷含量稳定在0.98～1.05 mg/g，不随发酵时间的增加而发生显著变化。皂苷是味苦的水溶性三萜，存在于藜麦的外层种皮中，藜麦皂苷已被证明具有抗炎活性，参与对癌细胞的抑制作用，并降低血清胆固醇水平[38]，因此本饮料酒中的皂苷对人体感官的苦味几乎消失。

图4 藜麦松露饮料酒发酵过程中活性成分（多酚、总黄酮、皂苷）的动态变化Fig.4 Dynamics of active components (saponins, polyphenols,total flavonoids) during fermentation of quinoa truffle alcoholic beverage

饮料酒中的多酚含量从0 h的7.74 mg/100 g增加至60 h的12.52 mg/100 g，这种增加可能是由于饮料酒发酵过程中产生的纤维素水解酶类物质导致麸皮中多酚的释放。多酚含量的增加在0～24 h内更为显著，在36～60 h内减缓并稳定；发酵48 h后，饮料酒中的多酚含量为12.09 g/100 g。

饮料酒的总黄酮含量总体呈下降趋势，0～24 h饮料酒中总黄酮含量下降趋势不明显；24～48 h下降趋势最大，48 h后趋于稳定；在发酵48 h后趋于稳定，含量为9.86 mg/100 g。总黄酮含量的下降可能是由于某些发酵细菌导致结合黄酮的分解，蒸煮过程导致藜麦黄酮含量显著降低[39]。

2.5 藜麦松露饮料酒发酵过程中还原糖含量的变化

由图5可知，发酵时间为0 h时，发酵基质中未检测到还原糖及其组分含量，在发酵12～48 h阶段，总还原糖及葡萄糖和麦芽糖不断产生，其含量随着发酵时间的延长而增加；当发酵48 h时还原糖和麦芽糖均达到最大值，分别为16.79 g/100 g和2.63 g/100 g，之后总还原糖含量和麦芽糖含量下降，葡萄糖含量继续增加，在发酵60 h达到最高值13.24 g/100 g，远远高于藜麦原料中还原糖含量（1.30～3.44 g/100g）[40]，可能是因为微生物在发酵过程中的生长和代谢需要充足的碳源来提供能量，本研究的发酵底物淀粉是最佳选择，发酵过程中随着淀粉被微生物水解生成双糖或单糖，总糖含量上升，同时还原糖为微生物提供了充足的碳源，并成为饮料中的天然甜味剂[41]。

图5 藜麦松露饮料酒发酵过程中还原糖含量的变化Fig.5 Changes of reducing sugar contents of quinoa truffle alcoholic beverage during fermentation

2.6 有机酸含量变化

由表3可知，通过对发酵过程各阶段有机酸含量的分析，总有机酸含量呈上升趋势，48 h时总有机酸含量为1 908.4μg/g，包括72.5μg/g草酸、410.6μg/g酒石酸、640.2μg/g乙酸、735.6 μg/g乳酸、25.5 μg/g柠檬酸和24.0 μg/g苹果酸；其中草酸、酒石酸和乙酸的含量达到最大值，占总有机酸的93.61%。草酸在一定程度上可以防止饮料变质，但食物中过量的草酸与肠道中的矿物质结合，形成不溶性矿物盐；酒石酸对酒精或发酵产品有芳香作用；乙酸为发酵饮料提供了温和的味道和独特的醇厚感，其独特的酸味清爽的味道使舌头上的苦涩回味变短；苹果酸是人体必需的有机酸，它也是一种具有天然苹果风味的三羧酸循环中间体；乳酸是一种非挥发性酸，可赋予饮用后具有后味的主要物质，不仅能提供温和的酸味，还能起到延长保质期的作用，在发酵食品中，乳酸能调节发酵底物中的pH，有利于发酵菌种的生长，还能抑制一部分杂菌的生长繁殖，它通常是食品酸化剂的首选。在发酵48 h时，各有机酸的含量处于相对均匀的介质中，达到较高水平，此时饮料酒的独特风味和每种有机酸的味道都得到了更好的体现。

表3 藜麦松露饮料酒发酵过程中有机酸含量的变化Table 3 Changes of organic acid contents of quinoa truffle alcoholic beverage during fermentation

2.7 游离氨基酸含量

由图6和表4可知，饮料酒中检测到17种游离氨基酸，总量为7.72 g/100 g，其中谷氨酸含量最高达1.38 g/100 g。在此饮料酒中7种必需氨基酸含量占总量的27.70%，其中亮氨酸含量最高达0.35 g/100 g。

图6 藜麦松露饮料酒中17种氨基酸含量测定结果Fig.6 Determination results of 17 amino acids in fermented of quinoa truffle alcoholic beverage

表4 藜麦松露饮料酒中必需氨基酸组成及含量Table 4 Composition and contents of essential amino acids in fermented of quinoa truffle alcoholic beverage

将饮料酒中7种必需氨基酸与氨基酸总量的比值与联合国粮食及农业组织（food and agriculture organization，FAO）/世界卫生组织（world health organization，WHO）模式的参考值进行比对，其中除了亮氨酸高于参考值（3.50），其他6种必需氨基酸均低于参考值（见表4）。氨基酸评分（amino acid scoring pattern，AAS）是样品中某种必需氨基酸与FAO/WHO模式下参考值的百分比，若其值越接近100%说明越接近标准模式蛋白，在饮料酒中的7种必需氨基酸的评分，除了苏氨酸（62.00%）、蛋氨酸（30.00%）和异亮氨酸（45.27%）三种氨基酸外，其余均比较接近或超过100%，说明藜麦松露糯米复配发酵低醇饮料酒中游离氨基酸总量较高，是一款氨基酸含量丰富且具有较高营养价值的饮料酒。

2.8 风味成分分析

由表5可知，在发酵后的藜麦松露饮料酒中共检出挥发性物质28种，共有15种酯类（47.17%）、6种醇类（49.98%）、2种酸类（0.64%）、2种酚类（0.80%）、2种烯类（0.20%）、1种酮类（0.22%），经过发酵后酯类和醇类物质种类和相对含量都是最高的，其中异丙醇（39.82%）和十六酸乙酯（31.55%）两种化合物的相对含量都较高。

表5 藜麦松露饮料酒挥发性风味物质GC-MS分析结果Table 5 Result of volatile flavor components of quinoa truffle alcoholic beverage analysis by GC-MS

2.9 关键风味物质及香气特征评价

通过ROAV法计算分析，丁酸乙酯、异丙醇、1-辛烯-3-醇和愈创木酚4种化合物的ROAV在1≤ROAV≤100范围内，是饮料酒的关键风味物质。其中丁酸乙酯常用于苹果、菠萝等食用香精和威士忌酒香精中[37]；1-辛烯-3-醇因其具有蘑菇香味而得名，主要天然存在于百里香和新鲜蘑菇中，在调制香料方面应用广泛，在发酵原料中1-辛烯-3-醇是松露中存在的独特风味成分，松露通过冷冻干燥、蒸煮、发酵等工艺后存留在饮料酒中起到了增加风味的作用，使饮料具有松露独特的风味；饮料酒中的异戊醇、丁酸、月桂酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯5种化合物的ROAV在区间0.1≤ROAV＜1内，对饮料的风味起到了一定修饰作用。通过嗅觉来对饮料酒的香气特征进行QDA，获得风味轮廓雷达图如图7，其中水果香和醇香的气味浓郁，其次还含有花香和焙烤香味，蘑菇香（1-辛烯-3-醇）是该饮料酒最为独特的香气。

图7 藜麦松露饮料酒的香气特征评价雷达图Fig.7 Radar map of aroma characteristics evaluation of fermentation of quinoa truffle alcoholic beverage

3 结论

本文以藜麦、松露和糯米为复合基质进行发酵，制成低醇饮料酒。分析了发酵过程中营养素和活性成分的动态变化，在发酵过程中，淀粉等大多糖逐渐降解为低分子量多糖，主要是葡萄糖。蛋白质的逐渐水解导致多肽和氨基酸含量增加，发酵48 h的总氨基酸态氮是发酵0 h的1.785倍，酒石酸和乙酸含量分别是发酵0 h的3.9倍和3.2倍。通过对藜麦松露饮料酒发酵过程中的营养成分分析，检测出7种人体必需氨基酸和10种非必需氨基酸，氨基酸总量为7.72 g/100 g；检出挥发性物质28种，包括15种酯类（47.17%）、6种醇类（49.98%）、2种酸类（0.64%）、2种酚类（0.80%）、2种烯类（0.20%）、1种酮类（0.22%），其中丁酸乙酯、异丙醇、1-辛烯-3-醇和愈创木酚4种化合物是饮料酒的关键风味物质。本研究为藜麦松露饮料酒多维品质评价技术奠定理论基础，为后期工业化生产和开发提供参考。