N6-甲基腺苷甲基化修饰在胃癌转移中的作用及机制研究进展

莫振昌，董 明，李晓华

(1.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712000;2.中国人民解放军空军军医大学第一附属医院消化外科,陕西 西安 710000)

最新的国际癌症数据显示,胃癌的发病率和病死率位于世界癌症总发病率和病死率的第5位和第4位[1]。我国每年胃癌的发病率为30.6/10万,病死率为29.6/10万,约占世界胃癌总发病率和病死率的43.9%和48.6%[2]。早期胃癌缺乏典型症状,超过半数胃癌患者确诊时为进展期。目前,胃癌的治疗有手术、化学治疗、放射治疗和分子靶向治疗等[3],这些治疗措施为不同阶段胃癌的治疗提供了更多选择,但是胃癌患者的5 a生存率仍较低,仅为35.1%[4]。癌细胞转移是胃癌患者预后不良的一个重要因素,往往造成初次手术治疗失败或需要二次手术切除再发病灶。胃癌的转移是一个复杂过程,其由多因素、多基因共同参与;因此,深入研究胃癌转移的作用机制成为亟需解决的难题。近年来,随着高通量测序技术的发展,N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)甲基化修饰在机体病理生理中的作用得到广泛关注;m6A甲基化修饰主要由甲基转移酶、去甲基转移酶和结合蛋白共同完成。m6A甲基化修饰通过参与mRNA剪切、衰退和翻译等整个代谢过程,调控肿瘤的发生发展、转移和化学治疗的耐药等恶性生物学行为。因此,本文就m6A甲基化修饰在胃癌转移中的作用研究进展做一综述,旨在从转录后修饰层面深入阐明胃癌转移的作用机制,以期为探索胃癌潜在的治疗靶点提供新思路,进而为临床上阻断胃癌转移的治疗提供理论基础。

1 m6A生物学特性

m6A甲基化修饰于20世纪70年代首次被发现[5-6],主要指发生在RNA中腺嘌呤(A)碱基的第6位碳原子上的甲基化修饰[7],是真核生物中最为常见的甲基化修饰[8-9]。既往研究显示,m6A参与RNA的整个过程,如RNA的翻译、剪切、降解、核输出等[10]。近年来,随着新技术的飞速发展,尤其是高通量测序技术的出现,发现m6A主要分布于蛋白质编码区、终止子附近和3′非编码区[7,11]。随着m6A去甲基化酶脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)和烷基化DNA修复蛋白alkB同源物5(alkylated DNA repair protein alkB homolog 5,ALBKH5)的相继发现及对其研究的深入发现,m6A甲基化修饰在机体内所发挥的功能是一个可逆、动态进程。m6A甲基化修饰由甲基转移酶催化发生甲基化、去甲基化酶将甲基去除和甲基结合蛋白特异性识别m6A甲基化修饰3个进程组成。研究发现,m6A甲基化修饰可通过调控肿瘤的增殖、分化、侵袭、转移[12-15]和对化学治疗药物的耐药[16]等恶性生物学行为在肿瘤进程中发挥重要作用。

2 m6A甲基化修饰在胃癌转移中的作用

2.1 m6A甲基化转移酶与胃癌转移

m6A甲基转移酶包括甲基转移酶样(methyltransferase-like,METTL)3、METTL14、METTL16、肾母细胞瘤抑制相关蛋白(wilms tumor suppressor associated protein,WTAP)、RNA结合基序蛋白15(RNA-binding motif protein 15,RBM15)、RNA结合基序蛋白15B(RNA-binding motif protein 15B,RBM15B)、含锌指CCCH结构域的蛋白质13(zinc finger CCCH domain-containing protein 13,ZC3H13)、VIR样m6A甲基转移酶(VIR like m6A methyltransferase,VIRMA)、锌指蛋白217(zinc finger protein 217,ZFP217)、E3泛素蛋白连接酶Hakai等[17];其中METTL3和METTL14 形成的甲基转移酶复合物[18]在体内外催化RNA发生m6A甲基化修饰,而WTAP和KIAA1429 以及其他m6A甲基转移酶也是其他不同甲基转移酶复合物的重要组成部分,这些m6A甲基转移酶都有固定的保守结构域。WTAP的重要功能是用于招募METTL3和METTL14[18-20]。METTL3、ZC3H13和RBM15可直接调控m6A修饰;METTL14没有催化结构域,但是可以辅助METTL3增加其催化效率,主要用于给RNA提供“骨架”[21]。 调控胃癌转移的m6A甲基转移酶主要集中于METTL3和METTL14上,其他的m6A甲基转移酶尚未见到与胃癌转移相关的研究报道。

研究发现,METTL3在胃癌中高表达,其表达水平与胃癌淋巴结转移、TNM分期呈正相关[22]。研究发现,METTL3的启动子H3K27被P300乙酰化激活,促进METTL3的转录,进而促进肝素结合生长因子(heparin binding growth factor,HDGF) mRNA的m6A甲基化修饰,使HDGF能够被m6A识别分子结合,从而增加其稳定性。HDGF在癌细胞生长、凋亡、转移和血管生成中发挥重要作用[19]。METTL3通过依赖HuR蛋白途径增加其靶点ZMYM1 mRNA的m6A甲基化修饰的稳定性,而ZMYM1招募C-末端结合蛋白/锌指家族蛋白LSD1/抑制因子元件1沉默转录因子辅助抑制因子1复合物的形成并抑制E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)启动子的活化,从而促进胃癌细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和转移进程[20]。此外,METTL3可降低Akt激酶(Akt kinase,AKT)磷酸化水平、下调其下游效应分子p70S6K与细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达而导致AKT信号通路失活。而下调METTL3表达可增加Bax和caspase-3活性,激活其介导的相关凋亡通路[21],从而抑制胃癌的转移。肽17对YAP1-tead信号通路的抑制降低了m6A甲基化修饰和YAP1的总mRNA水平,可抑制METTL3对胃癌细胞转移的促进作用[23]。METTL3还通过SPHK2/KLF2轴促进胃癌的转移[24]。除此之外,METTL3还可与非编码RNA相互作用促进胃癌的转移。研究发现,微RNA(microRNA,miR)-338-5p、miR-193b-5p和miR-1269b等在胃癌组织中低表达,miR-338-5p、miR-193b-5p和miR-1269b等非编码RNA过表达后,能够显著抑制METTL3的表达,从而抑制胃癌的转移[25-27]。综上所述,高表达的METTL3可通过多种机制促进胃癌的转移。

METTL14同样在胃癌转移的进程中发挥重要作用[21]。生物信息学分析发现,METTL14在胃癌组织中呈低表达,其表达水平与胃癌患者预后呈正相关[28]。METTL14在胃癌组织中的缺失可激活磷脂酰肌醇3-激酶/AKT/雷帕霉素激酶通路和EMT通路,进而促进胃癌细胞的增殖和转移。而有研究报道,METTL14在胃癌中发挥致癌作用,METTL14介导的m6A修饰导致LINC01320上调,过表达的LINC 01320通过调节miR-495-5p/RAB19轴促进胃癌细胞的侵袭性表型[29]。这2个截然相反的结论可能是由于研究者所使用的研究方法、样本等的不同而造成的;因此,需要更多的多中心研究来揭示其具体的作用机制。

研究显示,METTL3仅能结合约22%的m6A位点[30],因此,还存在其他的m6A甲基转移酶。如METTL16是最新研究发现的一个新m6A甲基转移酶,METTL16作用底物比较单一,具有U6 snRNA和S-腺苷甲硫氨酸合成酶 RNA 2个保守靶点。METTL16 将m6A标记安装在U6 snRNA和SAM合成酶pre-mRNA上,通过调节SAM稳态来控制m6A转录组的重要组分。METTL16与mRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)等有关[31]。研究发现, METTL16在胃癌组织和细胞中呈高表达,与胃癌TNM分期呈正相关,且与预后相关。METTL16可能通过上调胃癌细胞周期、调控Cyclin D1的表达来促进胃癌细胞增殖、转移[32]。

2.2 m6A去甲基转移酶与胃癌的转移

m6A去甲基转移酶包括FTO 和ALKBH5,主要介导m6A的去甲基化修饰。FTO是最早发现的m6A去甲基化酶,参与机体多种生物学过程,如细胞增殖、分化、凋亡、侵袭、迁移及细胞周期进展和干细胞自我更新等。研究发现,FTO与胃癌转移密切相关,FTO在胃癌中呈高表达,其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM 分期呈正相关[33]。整合素亚单位β1(integrin subunit beta 1,ITGB1)是FTO去甲基化和促进胃癌侵袭、转移的关键靶基因。FTO通过以m6A依赖性方式增强ITGB1表达,经整合素亚单位β1-黏着斑激酶途径促进胃癌细胞的迁移和侵袭。ALKBH5是另外一种主要的m6A去甲基酶,其通过调节肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、转移等生物学过程在多种肿瘤中发挥双重作用[34]。研究发现,ALKBH5和核旁斑装配转录本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)在胃癌细胞和组织中均呈过表达[35]。NEAT1是胃癌的一种正向转移调节因子,可促进体内外胃癌细胞转移,是ALKBH5的潜在下游靶点。ALKBH5通过去甲基化影响NEAT1和Zeste增强子同源物2的表达,从而促进胃癌的转移。

2.3 m6A结合蛋白与胃癌的转移

m6A结合蛋白主要识别RNA甲基化修饰信息,并参与下游mRNA的可变剪接、出核转运、翻译、降解及miRNA加工等过程[22]。m6A结合蛋白包括YTH家族蛋白[包括YTH N6甲基腺苷RNA结合蛋白F1/2/3(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein F1/2/3,YTHDF1/2/3)、YTH N6甲基腺苷RNA结合蛋白C1/2(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein C1/2,YTHDC1/2)]、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein,IGF2BP)1/2/3、异质核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,HNRNP)A2/B1、异质核核糖核蛋白C(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C,HNRNPC)、RNA结合基序蛋白X连锁、富含脯氨酸的卷曲线圈2A(proline rich coiled-coil 2A,PRRC2A)、脆性X信使核糖核蛋白1、富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子2及富含亮氨酸的五肽重复序列。

YTHDF1/2/3和YTHDC1/2可赋予m6A依赖性 RNA 的结合活性。含有YTH结构域的蛋白质参与许多RNA过程,例如 mRNA 剪接、核输出、翻译和转录后的调节。同时,YTH家族蛋白在肿瘤细胞周期进程、增殖、侵袭、迁移及炎症翻译、免疫调控和自噬等过程中也发挥重要作用[36-37]。一项基于TCGA 数据库和GEO数据库的生物信息分析研究显示,YTHDF1在胃癌组织中呈高表达,YTHDF1高表达与胃癌患者总体预后差密切相关,是胃癌患者预后不良的独立危险因素。YTHDF1调控的下游基因广泛参与了细胞增殖、蛋白酶复合体活性、细胞迁移、Wnt信号通路、泛素连接酶活性以及细胞外调节蛋白激酶级联反应等信号通路,在胃癌的转移中发挥重要作用。泛素特异性肽酶14 (ubiquitin specific peptidase 14,USP14)是YTHDF1在胃癌细胞中的m6A甲基化修饰靶点,YTHDF1可直接与USP14 mRNA结合,并以m6A依赖的方式促进其蛋白翻译,以m6A依赖的方式调控胃癌的转移,是胃癌治疗的一个潜在靶点[38]。与YTHDF1在胃癌组织和细胞中的高表达相反,YTHDF2在胃癌组织和细胞中呈低表达。YTHDF2表达水平与胃癌临床TNM分期和患者预后显著相关,肿瘤分级分期越差、恶性程度越高的胃癌组织中YTHDF2表达水平越低,患者预后生存时间越短。外源性过表达YTHDF2可抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。研究报道,YTHDF2可通过阅读叉头箱C2 mRNA的m6A修饰来调节其mRNA的稳定性,从而抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移[39]。另有研究显示,YTHDF2 mRNA在胃癌组织中的表达水平明显高于正常胃黏膜组织和相应的癌旁组织,下调YTHDF2表达可抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进细胞凋亡[40]。上述研究结果关于YTHDF2在胃癌中的表达和调控机制存在一定的矛盾性,尚有待于更多研究中心的后续实验证实。

IGF2BPs是胰岛素样生长因子家族成员,广泛参与细胞生长、分化、存活和代谢等进程,对机体的正常生长和发育至关重要。IGF2BP3在胃癌中表达升高,其表达量与胃癌转移密切相关。IGF2BP3的KH区与Circ-TNPO3可结合并相互作用,进而降低IGF2BP3富集的MYC mRNA水平。Circ-TNPO3可作为IGF2BP3蛋白的诱饵或抑制“海绵”来调节下游基因MYC的表达,进而抑制胃癌转移,这表明IGF2BP3可能是胃癌转移治疗的一个潜在靶点[41]。

HNRNP家族是m6A结合蛋白的重要组成分子,参与核酸代谢的多个方面,包括选择性剪接、mRNA稳定及转录和翻译调节,其异常表达与肿瘤的增殖、转移等密切相关。HNRNPA2B1在胃癌组织和细胞中高表达,与胃癌患者预后呈负相关[42]。BIRC5是HNRNPA2B1重要的下游靶点,外源性干涉BIRC5的表达能够有限抑制胃癌的转移,未来标准化治疗与HNRNPA2B1-BIRC5抑制剂联合使用将能更有效地消除胃癌细胞,进而降低胃癌转移的发生率[43]。此外,HNRNPA1的过表达可导致肿瘤细胞间的接触丧失,细胞膜表面出现肌动蛋白聚合所必需的伪足和片脂,导致肿瘤细胞发生侵袭、迁移。因此,靶向HNRNPA1有可能成为胃癌治疗的新手段。

3 结论

RNA表观遗传学是近年来研究的热点。m6A甲基化修饰是最为丰富的RNA修饰之一,影响RNA的转录、剪切、加工。由于肿瘤的高度异质性和m6A底物修饰的广泛性和丰富性, m6A在不同类型的肿瘤中发挥促癌或者抑癌作用,即使在同一种类型的肿瘤中,不同的研究者对于m6A的表达水平得出的结果也不尽相同,m6A在癌症中的作用机制尚不清楚。

虽然,既往大量研究对m6A甲基化修饰在胃癌转移中的作用机制及其作为潜在分子标志物的可能性进行了报道,但很少从药物治疗的角度上探索m6A甲基化修饰与胃癌的相关性。目前,m6A甲基化修饰的研究主要还存在以下问题:m6A甲基化修饰在肿瘤中详细而精确的调控机制还没有阐明;m6A作为肿瘤标志物的特异性和敏感性还没有得到验证;单独干预m6A或联合其他方法治疗肿瘤的可行性目前尚无相关文献报道;虽然现有的文献报道已证实,m6A甲基化修饰在胃癌转移中发挥重要调控作用,并影响着患者的预后;但鉴于目前m6A下游调控分子还不确切,迫切需要研究人员进行更深入的研究来阐明m6A甲基化修饰在胃癌转移中的精准调控机制。