一种测定农药氨基寡糖素含量的高效液相色谱方法

邓晓娇，颜聪，薛建强，潘朝晖

(江苏龙灯化学有限公司，江苏 昆山 215300)

氨基寡糖素(amino-oligosaccharin)也称为农业专用壳寡糖，是从海洋生物如虾类、蟹类等的外壳提取而来的多糖类天然产物，由几丁质降解得壳聚糖后再降解制得的，或由微生物发酵提取的低毒杀菌剂，其不仅可刺激植物生长，使农作物增产，还有抑制植物病毒的作用，对小麦花叶病、棉花黄萎病、水稻稻瘟病、番茄疫病等具有良好的防治作用[1-2]。目前已进行了大面积推广应用，对低毒高效农药的发展具有十分重要的意义。

关于氨基寡糖素产品中氨基寡糖素含量的测定，目前主要采用分光光度法[3-4]、离子色谱法等[5-6]。分光光度法是将氨基寡糖素经盐酸水解为氨基葡萄糖，氨基葡萄糖经衍生反应后用显色剂显色，然后在特定波长处测定吸光度，但该方法干扰因素多，稳定性较差。离子色谱法使用脉冲安培检测器和高效阴离子交换柱测定氨基寡糖素水解产物氨基葡萄糖，但离子色谱价格高昂，对企业适用性较差。基于此，为了满足企业日常分析需求，降低分析检测成本，本文采用高效液相色谱仪建立一种与NY/T 2889—2016[6]中离子色谱法结果一致、水解时间更短的氨基寡糖素含量测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC20A 液相色谱仪配PDA 检测器[岛津(中国)有限公司]；XS 205 型分析天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]；SK5200 型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；有机过滤器(孔径0.45µm)。HH-5C 型数显恒温油浴锅(常州市顶新实验仪器有限公司)；Smart-S30 实验室超纯水系统(上海和泰仪器有限公司)。

氨基葡萄糖盐酸盐标样(质量分数≥99.0%，SIGMA 试剂公司)；氨基寡糖素母药(质量分数≥85.0%，潍坊华诺生物科技有限公司)；8%氨基寡糖素可溶液剂(江苏龙灯化学有限公司研发小样)；乙腈，色谱纯；甲醇、三氯甲烷、盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，均为分析纯；超纯水。

1.2 检测方法

氨基寡糖素用8 mol/L 盐酸水解成氨基葡萄糖，水解得到的氨基葡萄糖用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生，用三氯甲烷萃取除去过量的PMP 后，衍生物经高效液相色谱分离，用PDA 检测器检测，外标法测定。

1.3 测定步骤

1.3.1 样品水解

称取相当于氨基寡糖素0.02 g 的样品于水解管中，加8 mol/L 盐酸5.0 mL，混匀，充入高纯氮气，密封。于(98±2) ℃油浴中水解4 h，每小时摇动1 次样品。取出水解管，于流水下冷却。将水解管中水解液转移至100 mL 烧杯中，用5 mL 超纯水洗涤水解管3 次，洗涤液并入100 mL 烧杯中。向烧杯中加入10 mol/L 氢氧化钠4 mL，用0.3 mol/L 氢氧化钠或0.3 mol/L 盐酸调pH 至7.0。将烧杯中溶液转移至100 mL 容量瓶，烧杯用5 mL 超纯水洗涤3 次，洗涤液并入100 mL 容量瓶中，冷却用超纯水定容至刻度，得到样品水解溶液，备用。

1.3.2 标样制备

称取约0.4 g 氨基葡萄糖盐酸盐试样(氨基葡萄糖盐酸盐转换成氨基葡萄糖的系数为0.830 9)于100 mL容量瓶中，用超纯水溶解，定容至刻度，得到质量浓度约3.3 mg/mL 氨基葡萄糖贮备液。取6 只100 mL容量瓶，分别移取氨基葡萄糖贮备液0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，用超纯水定容至100 mL，得到质量浓度为0、33、66、132、198、264 mg/L 氨基葡萄糖标准溶液，备用。

1.3.3 衍生和萃取

取不同质量浓度的氨基葡萄糖标准溶液各0.50 mL和各样品水解溶液0.50 mL 分别置于数只10 mL 具塞比色管中，每个比色管中加入0.5 mol/L PMP 甲醇溶液0.50 mL 和0.3 mol/L 氢氧化钠溶液0.50 mL，混匀，于(70±2)℃水浴衍生60 min。取出，流水下冷却至室温，加0.3 mol/L 盐酸溶液0.50 mL，摇匀。再加4.0 mL 三氯甲烷萃取3 次，取上层水相用0.45µm滤头过滤，得到质量浓度为0、33、66、132、198、264 mg/L 的氨基葡萄糖-PMP 标准待测液6 份和样品的待测液若干。

1.3.4 色谱分析

色谱柱SB-C18150 mm×4.6 mm，i.d.5µm；流动相：乙腈+磷酸二氢钾缓冲液=15+85(体积比)；流速1.0 mL/min；测定波长254 nm；进样体积5µL。在上述色谱操作条件下，氨基葡萄糖-PMP 衍生物保留时间约为17.5 min。

待仪器稳定后连续注入数针标样溶液，直至相邻2 针氨基葡萄糖-PMP 标准待测液标的响应值相对变化＜10%后，按照先各标准待测液后样品待测液的顺序测定，以仪器上测定的氨基葡萄萄糖-PMP标准待测液的质量浓度(mg/L)为横坐标，液相色谱吸光度为纵坐标绘制标准曲线。氨基葡萄糖标样-PMP 及氨基寡糖素样品-PMP 的典型液相色谱图见图1。

图1 氨基葡萄糖标样-PMP 和氨基寡糖素样品-PMP 的色谱图

1.3.5 计算

将样品峰面积带入标准曲线计算出相应样品待测液中氨基葡萄糖质量浓度C(mg/L)，试样中氨基寡糖素的质量分数ω(%)按下式计算：

式中：ω为氨基寡糖素质量分数(%)；C 为样品待测液的质量浓度(mg/L)；m为样品的实际称样量(g)；100 为样品的稀释倍数；k为校正系数，氨基寡糖素在降解为氨基葡萄糖过程中的损失k=1.7(参照NY/T 2889—2016中离子色谱法计算系数)；10-6为mg/L换算成g/mL 值。

2 结果与讨论

2.1 水解条件

2.1.1 水解酸度

实验选用6、8、12 mol/L 的盐酸在(98±2)℃油浴中对氨基寡糖素母药进行水解(图2)。可见，在6 mol/L 盐酸水解液中，氨基寡糖素水解缓慢。在12 mol/L 盐酸水解液中，氨基寡糖素水解速度快，但是其水解产物氨基葡萄糖易被破坏。而在8 mol/L盐酸水解液中样品水解程度高且水解产物氨基葡萄糖在一段时间内稳定，易于检测。

图2 水解酸度对氨基寡糖素含量测定的影响

2.1.2 水解时间

样品加8 mol/L 盐酸溶液5.0 mL 在(98±2)℃油浴中分别水解1、2、3、4、5、6、7、8 h 后测定氨基寡糖素含量。以水解时间为横坐标，氨基寡糖素含量为纵坐标，绘制关系图(图3)。可见，样品水解4～8 h 测定的氨基寡糖素含量达到峰值。为更快得到较优水解样品，选择水解时间为4 h。

2.1.3 衍生时间

各选择1 份水解4 h 的氨基寡糖素可溶液剂和氨基寡糖素母药的水解液与PMP 衍生试剂在(70±2)℃水浴中衍生，分别衍生30、50、60、70 min，实验结果如图4。可见，(70±2)℃水浴衍生60 min后样品中的氨基葡萄糖与PMP 能反应完全。

图4 衍生时间对氨基寡糖素含量测定的影响

2.2 线性关系

氨基葡萄糖盐酸盐经水解、衍生、萃取、过滤得到6 份质量浓度为0、33、66、132、198、264 mg/L氨基葡萄糖标准-PMP待测溶液，每个待测液取5µL注入高效液相色谱仪测量保留时间和峰面积，每个质量浓度测定2 次，取峰面积平均值，以质量浓度(mg/L)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：氨基葡萄糖质量浓度在1～264 mg/L 线性相关性良好，回归方程y=11 451x-2 318.1，线性相关系数为0.999 9。

2.3 方法精密度

在上述色谱条件下称取约0.3 g 的氨基寡糖素可溶液剂和0.02 g 氨基寡糖素母药各7 份，按2.3 节步骤处理后测定，结果见表1。氨基寡糖素母药的相对标准偏差为0.69%，理论相对偏差1.34%；氨基寡糖素可溶液剂的相对标准偏差为1.43%，理论相对偏差1.95%；均符合要求。

表1 分析方法的精密度

2.4 方法回收率

称取10 份取氨基寡糖素母药(每份约0.015 g)，均分成2 组：第1 组每份各加3.3 mg 氨基葡萄糖，按2.3 节步骤水解处理后衍生测定加标回收率；第2组样品先按2.3.1 节步骤水解，再加3.3 mg 氨基葡萄糖后衍生测定加标回收率，氨基寡糖素水剂样品操作同氨基寡糖素母药。结果表明：氨基寡糖素母药和氨基寡糖素可溶液剂的水解加标回收率分别为95.1%～98.2%和95.2%～99.4%，水解后加标衍生的回收率分别为97.6%～104.1%和98.5%～103.8%。

2.5 与离子色谱法结果比对

同一批氨基寡糖素母药和氨基寡糖素可溶液剂样品按照NY/T 2889—2016 中离子色谱法分析，其中氨基寡糖素母药和氨基寡糖素可溶液剂的含量分别为99.6%和8.0%，与本试验中的98.1%和8.3%的结果差值在5%以内，2 种方法测定结果一致性高。

3 结论

本文建立了一种可以简单快速分析氨基寡糖素的高效液相色谱检测方法，目标物在测试浓度范围内线性关系良好、方法精密度和准确度高，且水解时间短，适用于氨基寡糖素产品中有效成分的快速检测与分析。