不同类型盐胁迫对小黑麦种子萌发的影响

孟晨，鲁雪莉，王菊英，魏云冲，张成省，李义强，徐宗昌*

（1. 中国农业科学院烟草研究所海洋农业研究中心，山东 青岛 266100；2. 国家盐碱地综合利用技术创新中心，山东 东营 257345；3. 青岛市滨海盐碱地资源挖掘与生物育种重点实验室，山东 青岛 266100；4. 青岛农业大学农学院，山东 青岛 266109）

土壤盐渍化是制约农业发展的主要因素之一，可造成离子毒害和渗透胁迫，严重影响植物的品质与产量［1］。盐渍土中含有的盐类主要有氯化钠、硫酸钠、碳酸氢钠、硫酸镁等，在很大程度上限制农业生产的可持续发展，盐碱地利用改良面临巨大的挑战。培育耐盐植物品种是改良和利用盐碱地的重要措施，植物的耐盐性鉴定与评价尤为重要［2］。小黑麦（Triticale）是通过小麦（Triticum aestivum）和黑麦（Secale cereale）属间杂交，应用染色体工程育种技术人工培养的异源多倍体新物种，结合了小麦和黑麦的优点，具有高产、优质、抗逆性强、适应性广等杂种优势，具有改良盐碱地的作用［3-4］。

种子萌发期是植物对环境胁迫最敏感的时期，直接影响植物的生长发育［5-7］。种子在萌发阶段的耐盐性在一定程度上反映了其耐盐程度［8］。盐胁迫会对植物产生渗透胁迫和离子毒害，进而限制植物的生长发育［9］。种子能否在盐碱环境下发芽成苗是决定该植株在该环境下是否完成整个生长发育过程的关键［10］。因此，研究植物在萌发期的耐盐性有着重要的意义。以往对小黑麦耐盐性的研究多集中在NaCl 胁迫条件，耐盐机制主要涉及植株发育、生理生化及分子等水平，也有少量Na2SO4和NaHCO3的研究报道，认为NaCl、Na2SO4和NaHCO3对植物毒性的差异可能是由于不同的阴、阳离子的作用机制不同导致的［3，11-12］。因此本研究利用不同浓度的NaCl，KCl，Na2SO4，MgSO4，NaHCO3单盐及NaCl、Na2SO4和NaHCO3按照一定比例混合的混合盐对小黑麦进行胁迫处理，以明确不同类型盐胁迫对小黑麦种子萌发的影响，以期为利用小黑麦改良盐碱地提供重要的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验小黑麦材料为晋饲草1 号，由东营农高区盐碱地试验中心保存，2022 年夏收后用于试验。

1.2 试验方法

1.2.1 浓度设置 根据李鸿文等［11］的盐胁迫试验，对NaCl，KCl，Na2SO4，MgSO4，NaHCO3采用摩尔浓度，分别设置0（CK），10，25，50，100 和200 mmol·L-1共计5 个盐浓度梯度。混合盐（salts mixture）按照NaHCO3∶NaCl∶Na2SO4=1∶15∶84 配制［13］，设置0（CK），0.05%，0.15%，0.30%，0.60%和1.20%共计6 个盐浓度。以上溶液均用蒸馏水配制。

1.2.2 萌发试验 挑选籽粒饱满、大小均一的小黑麦种子用自来水揉搓清洗3 次，去除表面灰尘和杂菌，然后使用10%的NaClO 溶液颠倒清洗数次，最后用无菌水冲洗3 次，得到表面无菌种子。在直径为9 cm 的垫有双层滤纸的培养皿中加入5 mL 不同浓度的处理溶液，每个处理设置3 个重复，以蒸馏水作为对照处理。每个培养皿中放置30 粒小黑麦种子，从第3 天开始（生长的小黑麦芽高于培养皿）每天更换新培养液以保持处理浓度始终一致和保证足够的水分供小黑麦生长。将培养皿放置在光周期为16 h 光照，8 h 黑暗，温度（24±1） ℃，湿度60%的植物培养间进行培养［14］。

1.3 测定指标

以胚芽长于种子1/2 作为萌发标准，逐日统计萌发种子数，以第3 天发芽种子数占种子总数的百分比作为发芽势（germination energy， GE）［3］，第7 天时以发芽数占种子总数的百分比作为发芽率（germination rate， GR），并测量株高（seedlings length， SL）和根长（root length， RL）以及根数（roots number， RN，大于籽粒50%的须根作为有效根）。

1.4 数据分析

使用Microsoft Excel、SPSS 17.0 等软件进行平均值、方差、显著性、主成分以及隶属函数等多元分析。相关公式如下：

式中：GI为发芽指数（germination index）；DG为逐日发芽数（daily germination）；DT为相应DG的发芽天数（germination days）；SVI为简易活力指数（simple vigor index）；GR为发芽率；SL为株高；RSIR为相对盐害率（relative salt injury rate， %）；CK1、CK2、CK3分别代表对照重复Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 的发芽率；T1、T2、T3分别代表盐处理重复Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的发芽率。

式中：U表示隶属函数值；Xij表示第i个种质的第j个主成分分值；Xjmax表示第j个主成分的最大值；Xjmin表示第j个主成分的最小值。

2 结果与分析

2.1 不同类型和浓度盐胁迫下小黑麦萌发特征分析

小黑麦种子萌发峰值时间在6 种盐处理的低浓度条件下基本都是第2 天（图1）；在NaCl 和KCl 处理下，除200 mmol·L-1处理组外，其他浓度处理组的萌发趋势较为一致，较高浓度处理组的种子萌发数少；除NaCl 和KCl外，小黑麦种子在中高浓度盐溶液处理组中的最大萌发峰值均有推迟现象，以Na2SO4、NaHCO3和混合盐处理组的表现明显。50 mmol·L-1NaHCO3对小黑麦种子的萌发表现出了明显的抑制作用，小黑麦种子的最大萌发峰值推迟，萌发粒数较少。在100 mmol·L-1的Na2SO4和NaHCO3处理下，小黑麦种子的最大萌发峰值推迟为第3 天，且NaHCO3处理组的萌发数低于Na2SO4处理组，小黑麦种子的萌发受到了显著的抑制。

图1 不同盐处理下小黑麦的萌发曲线Fig.1 The germination curve of triticale under different salt treatments

2.2 不同类型盐胁迫对小黑麦种子萌发指标的影响

随着盐处理浓度的升高，小黑麦的发芽率和发芽势总体呈下降的趋势（表1）；当KCl 处理浓度为200 mmol·L-1时，小黑麦种子的发芽势较对照降低了90%，发芽率较对照降低了68.89%；当MgSO4处理浓度为200 mmol·L-1时，发芽势较对照降低了43.33%，发芽率较对照降低了80%；在200 mmol·L-1的NaCl、Na2SO4和NaHCO3处理下，小黑麦种子不发芽，表明高浓度的盐处理对小黑麦种子的萌发有显著的抑制作用。在100 mmol·L-1NaHCO3处理条件下，小黑麦的发芽势和发芽率与对照相比分别降低了48.33%和75.56%，在相同Na+浓度条件下，NaHCO3对小黑麦的抑制毒害作用较强；在50 和100 mmol·L-1处理浓度下，KCl 对小黑麦种子萌发率的影响小于NaCl，在200 mmol·L-1处理浓度下，KCl 对种子萌发率的影响最小；在混合盐处理组浓度为0.60%和1.20%时，小黑麦种子的发芽势与对照组相比有显著降低，分别降低了8.33%和26.67%，混合盐处理浓度为0.15%，0.30%，0.60%和1.20% 时，种子的发芽率与对照组相比有显著差异，较对照组分别降低了6.67%，5.56%，8.89%和42.23%。

表1 不同类型盐胁迫对小黑麦种子萌发指标的影响Table 1 Effect of different salt stresses on germination indicators of triticale seeds（%）

10 mmol·L-1NaCl 处理组相对盐害率为0，对小黑麦生长没有影响（表1）；200 mmol·L-1的NaCl、Na2SO4和NaHCO3处理组的相对盐害率为100%，小黑麦不能存活，而200 mmol·L-1的KCl 和MgSO4处理组则有少量的小黑麦种子可以生长，与发芽率结果一致；低浓度盐处理条件下（10～25 mmol·L-1），以相对盐害率作为评价指标，小黑麦的耐受能力依次为NaCl，混合盐，KCl， MgSO4， Na2SO4和NaHCO3；中浓度盐处理条件下（50～100 mmol·L-1），小黑麦的耐受能力依次为KCl， NaCl，混合盐，MgSO4，Na2SO4和NaHCO3。

2.3 不同类型和浓度盐胁迫对小黑麦发芽指数和活力指数的影响

随着盐浓度的增加，发芽指数和活力指数均呈逐渐降低的趋势（表2）。高浓度盐胁迫对小黑麦种子的发芽指数和活力指数抑制作用显著。NaCl 和KCl 处理浓度在100 mmol·L-1及以下，小黑麦种子的发芽指数与对照组无显著差异；当NaCl 和KCl 处理浓度达到100 mmol·L-1时，小黑麦种子的活力指数与对照组差异显著；当MgSO4处理浓度达到50 mmol·L-1时，处理组的发芽指数、活力指数与对照组相比呈显著差异；在25、50 及100 mmol·L-1Na2SO4处理条件下，种子的发芽指数、活力指数与对照组相比均有显著差异；10 mmol·L-1NaHCO3处理组的种子发芽指数与对照组相比有显著差异，活力指数小于对照组，表明NaHCO3对小黑麦种子的发芽指数和活力指数的抑制作用显著，与发芽率和发芽势趋势一致。混合盐处理组浓度达到0.60%和1.20%时，种子的发芽指数、活力指数与对照组相比有明显差异，与发芽率和发芽势的趋势一致。

表2 不同类型盐胁迫对小黑麦种子发芽指数和活力指数的影响Table 2 Effect of different salt treatment on seed germination index and vigor index

2.4 不同盐胁迫对小黑麦幼苗株高和根发育的影响

小黑麦的株高随着盐浓度的增加总体呈逐渐降低的趋势（图2）。当Na2SO4、MgSO4和NaHCO3的浓度为100 mmol·L-1时，小黑麦幼苗株高降低为3.25，3.89 和1.91 cm，均在对照组的30.00% 以下。200 mmol·L-1NaHCO3处理组的小黑麦不能正常发芽，NaCl、KCl、Na2SO4和MgSO4的处理浓度为200 mmol·L-1时，小黑麦的株高分别为对照组的8.77%，18.98%，2.98%和12.56%，高浓度盐处理显著抑制小黑麦幼苗株高。NaCl 和KCl 处理对小黑麦株高的影响相对较小，10～50 mmol·L-1NaCl 处理组的株高分别为12.11，12.56 和11.48 cm，10 和25 mmol·L-1KCl 处理组的株高分别为12.18 和11.86 cm，均高于对照组，说明低浓度的NaCl 和KCl 对小黑麦的株高有一定的促生作用，但差异不显著；混合盐表现较为均衡，除0.30%混合盐处理组的株高略高于对照外，其他处理组株高均低于对照组，0.60%和1.20%混合盐处理组的株高与对照组相比有显著差异，分别为对照组株高的56.01%和49.42%。

图2 盐胁迫下小黑麦的株高、根长及须根数目Fig. 2 Seedling length， root length and fiber root number of triticale under salt stress

小黑麦的根长也随着盐处理浓度的增加呈逐渐降低的趋势（图2）。当KCl、Na2SO4、MgSO4和NaHCO3的处理浓度为10 mmol·L-1时，小黑麦的根长被显著抑制，分别为对照组的52.69%，49.50%，41.76%和50.49%。10 和25 mmol·L-1NaCl 处理组的根长与对照组没有显著差异，在NaCl 处理浓度为50～200 mmol·L-1时，对小黑麦根长的抑制作用明显，处理组小黑麦的根长分别为对照组的59.60%，55.20%和21.56%。200 mmol·L-1的MgSO4和100、200 mmol·L-1的NaHCO3胁迫处理下小黑麦不长根。 200 mmol·L-1的NaCl，KCl 和Na2SO4、MgSO4处理组中小黑麦的须根数比对照组显著减低，其余处理组对须根数目影响不大。

2.5 主成分分析

对小黑麦的7 个指标进行主成分分析，以特征值大于1 为标准，除混合盐处理提取出2 个主成分外，其余处理组都只提取到1 个主成分（表3）。NaCl 处理下主成分贡献率为94.931%，在发芽率上有最大载荷，反映的是萌发。KCl 的主成分贡献率为85.787%，在发芽指数上有最大载荷，反映的是种子活力。Na2SO4的主成分贡献率为90.013%，简易活力指数占最大载荷，反映的是种子活力。MgSO4的主成分贡献率为90.290%，在须根数目上有最大载荷，反映的是根系发育。NaHCO3的主成分贡献率为94.765%，在发芽率上有最大载荷，反映的是种子萌发。混合盐处理的第1 主成分贡献率为78.149%，其在发芽指数上有最大载荷，反映的是种子活力；第2 主成分贡献率为17.521%，其在须根数目上有最大载荷，反映的是根系生长。

表3 耐盐性指标的主成分分析Table 3 Principal component analysis of salt tolerance evaluation indexes

2.6 隶属函数综合分析

模糊隶属函数法可综合各耐盐性指标，依据其隶属函数值排序综合评价盐胁迫下小黑麦的耐盐性，可避免单一指标评价所带来的片面性从而更加客观真实。排序结果显示（表4），CK 最好，其次是25 mmol·L-1NaCl，未鉴定到促生盐类和浓度，各类型盐和浓度对小黑麦的生长均有抑制作用。在低浓度盐处理（10、25 mmol·L-1）条件下，小黑麦对不同类型盐的耐力排序为：NaCl＞KCl＞MgSO4＞Na2SO4＞NaHCO3，在中浓度盐处理（50、100 mmol·L-1）条件下，小黑麦对不同类型盐的耐受能力为NaCl＞KCl＞Na2SO4＞MgSO4＞NaHCO3，在200 mmol·L-1处理条件下，小黑麦对不同类型盐的耐受能力为KCl＞MgSO4＞NaCl＞Na2SO4＞NaHCO3，小黑麦对混合盐处理的耐受能力排序为0.30%＞0.05%＞0.15%＞0.60%＞1.20%。

表4 隶属函数值及耐盐性综合评价Table 4 Subjection values and comprehensive evaluation of salt tolerance of triticale under different salt treatments

3 讨论

目前对作物耐盐评价及鉴定工作主要集中于水稻（Oryza sativa）［15-17］、小麦［18-19］、玉米（Zea mays）［20］和大豆（Glycine max）［21］等作物，且多为单一NaCl 处理。本研究除了分析NaCl 胁迫外，增加了KCl、Na2SO4、MgSO4和NaHCO3胁迫处理以及NaCl、Na2SO4和NaHCO3混合盐胁迫，有利于更全面地分析评价小黑麦的耐盐性。盐胁迫对于作物不同发育时期的影响不同，且不同发育阶段的耐盐性没有直接相关性［14］。种子萌发及幼苗生长是植物生长发育及适应环境的基础，同时也是盐胁迫下最为敏感极易遭受危害的阶段。处于盐胁迫下的种子常表现出发芽率降低、活力下降、生长受抑制等现象，严重时种子甚至不能萌发。种子萌发期对不同盐的反应往往最能体现该植物对不同盐处理的耐受性。

本研究使用不同浓度的NaCl、KCl、Na2SO4、MgSO4和NaHCO3对小黑麦种子萌发阶段进行胁迫。结果表明，随着Na2SO4、MgSO4和NaHCO3盐溶液浓度的增加，小黑麦种子的最大萌发峰值有延迟现象。盐胁迫下的小黑麦种子的发芽率和发芽势都要低于对照，且在不同盐处理下随着浓度的升高表现出不同程度的降低。高浓度盐处理对小黑麦种子萌发抑制作用显著，与郭文婷等［22］对一年生草本植物雾冰藜（Bassia dasyphylla）、刺沙蓬（Salsola ruthenica）和白茎盐生草（Halogeton arachnoideus）的钠盐胁迫结果一致，推测可能是由于处理液中含有大量的离子，抑制了种子中代谢相关酶活性，细胞代谢紊乱，抑制种子萌发，或是由于较高的离子浓度增加了种子渗透势，导致质壁分离，影响种子的吸胀，从而使种子萌发力下降。值得注意的是，在相同浓度处理条件下，NaHCO3对小黑麦种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数的抑制作用最明显，可能与其较高的pH 有关。试验结果显示，5 种单盐胁迫处理对小黑麦种子萌发的抑制作用为NaHCO3＞Na2SO4＞MgSO4＞NaCl＞KCl，与李玉梅等［23］和吉小敏等［24］分别在肥皂草（Saponaria officinalis）种子、盐桦（Belula halophila）种子萌发中NaHCO3抑制作用最显著，Na2SO4比NaCl 的抑制作用更大的结果一致。本研究推测可能是碱性盐的高pH 对小黑麦种子的萌发抑制作用要大于中性盐，而由于相同浓度处理条件下，Na2SO4盐溶液中含有的Na+浓度高于NaCl，对种子产生的离子毒害更强，从而对小黑麦的萌发产生了更明显的抑制作用，这也与黄立华等［25］的观点一致。

不同种类和不同浓度的盐胁迫对小黑麦幼苗的生长也表现出不同程度的影响。测定处理7 d 的小黑麦幼苗株高和根长，结果发现，低浓度的NaCl 和KCl 对小黑麦幼苗株高有一定的促进作用。在中高浓度条件下，5 种盐处理对小黑麦幼苗株高和根长的抑制作用明显，其中NaHCO3的作用最显著。以上结果可能是由于NaHCO3作为一种碱性盐，不仅通过渗透作用和离子毒害抑制小黑麦种子萌发和幼苗生长，还造成了较高pH 的影响。碱性环境下，细胞为了维持正常的生命活动，需要消耗更多的物质和能量去对抗pH 过高的逆境，进而生长受到抑制［26-27］。

植物耐盐性是由多种因素间的交互影响及协同作用而决定，因此本研究同时利用相对盐害率、主成分分析和隶属函数法等分析小黑麦在不同盐处理下的耐盐性。主成分分析表明，评价小黑麦耐盐性的主要指标为发芽率、发芽指数及根长，与现有研究报道有一定的相似性。陈新等［28］研究发现与裸燕麦（Avena nuda）萌发期耐盐性关系密切的指标为发芽势和发芽率。谢楠等［29］认为存活率、株高及地上生物量等与小黑麦的耐盐性显著相关。此外，隶属函数值排序表明，小黑麦对混合盐处理的耐受度相对较高，对NaHCO3的耐受度最低，在中低浓度（10～100 mmol·L-1）盐处理下，小黑麦对Cl-盐类的耐受力高于SO42-盐类，而在高浓度处理条件下，小黑麦对含有Na+的盐处理耐受能力较差。以上研究结果为小黑麦的耐盐评价鉴定提供了重要依据。

4 结论

在单盐胁迫及混合盐胁迫下，小黑麦种子的萌发及幼苗生长都受到了抑制。同等浓度下，NaHCO3对小黑麦种子萌发和幼苗生长的抑制作用最强。筛选出了发芽率、发芽指数和根长是对小黑麦进行耐盐性评价及鉴定的重要指标，在同等试验条件下可以作为小黑麦萌发期耐盐性鉴定的评价及筛选指标。