梨树冠层光响应基因PpPRR5b克隆与功能分析

刘 政,易善萍,2,李谢雨,杨 立,程寅胜,聂显双,张 爽,黎兰献,和世玉,伍 涛

(1 湖北省农业科学院果树茶叶研究所/果树种质创新与利用湖北省重点实验室,武汉,430064;2 华中农业大学园艺林学学院,武汉,430070;3 枣阳市精致农业有限公司,枣阳,441200;4 武汉市东西湖区农业技术推广中心,武汉,430040)

生物钟(circadian clock)是生物适应环境周期性变化的一种普遍内在调节机制[1-2]。植物可通过生物钟机制产生与环境信号(如光照、温度等)相适应的节律,在生长发育、环境响应等生命活动中发挥重要作用[3]。伪应答调控(pseudo-response regulator,PRR)蛋白家族是植物生物钟中央振荡器的重要组成部分[4-5]。PRR蛋白家族包含一个N端REC伪响应调节受体域(pseudo-receiver domain)以及C端植物特有的CCT(CONSTANS/CONSTANS-like/TOC1)结构域[6]。PRR基因的功能在模式植物拟南芥中研究最为深入。拟南芥Arabidopsisthaliana一共包含5个PRR家族成员,它们的表达是按照AtPRR9→AtPRR7→AtPRR5→AtPRR3→AtPRR1/AtTOC1的顺序从黎明到黄昏依次转录到最高峰,具有明显的生物周期节律;它们被报道参与了非生物反应、细胞延伸和光周期开花反应等生物过程[3,7-9]。例如,PRR5通过与ABI5(ABSCISIC ACID INSENSITIVE 5,脱落酸不敏感蛋白5)互作,进而介导了ABA(abscisic acid,脱落酸)信号,在拟南芥种子萌芽过程起到调控作用[10]。超量表达AtPRR5表现出在红光下呈现下胚轴变短的特征[11],而Atprr5单突变体表现完全相反的表型[12],说明AtPRR5在光形态建成方面具有重要功能。

梨是我国重要的果树物种,其栽培模式影响了光照在冠层内的渗透与分布,进而对果实产量和品质产生影响[13]。本课题组前期对不同栽培模式梨(Pyrus)光合特性进行生理学测定,并与转录组表达进行了关联分析[14]。通过生物信息学方法发现,“植物-生物钟周期节律”代谢途径在梨树净光合速率表型相关性最高的基因模块中显著富集,这个代谢途径上的PpPRR5a(LOC103943360)和PpPRR5b(LOC103951583)被鉴定是该基因模块的核心基因(hub gene)。系统进化树分析表明,PpPRR5a和PpPRR5b是拟南芥AtPRR5的同源基因;它们在红光增强条件下的梨叶组织中呈现出上下波动的表达变化模式,而在蓝光增强的条件下则表现出先持续上升后下降的表达变化趋势,这说明PpPRR5a和PpPRR5b确实是能够受到光信号的调控[15]。瞬时表达PpPRR5a基因能够抑制烟草净光合速率,表明PpPRR5a是一个在光合作用中起负调控作用的基因[15]。然而,PpPRR5b基因尚未被克隆,其在果树中调控光合作用的功能还有待进一步的验证。本研究克隆PpPRR5b基因,利用瞬时遗传转化分析其功能,以期为分子育种途径培育高光效种质提供优良基因资源,为高光效管理模式创新提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料用于基因克隆的材料是湖北省农业科学院果树茶叶研究所梨育种试验基地的圆黄梨(P.pyrifolia‘Wonhwang’)9年生树的叶片。用于瞬时转化试验的本氏烟草(Nicotianabenthamiana)种植于基质土中,在光照培养箱中培养,培养温度25 ℃,相对湿度60%,光照时间14 h/10 h。烟草长出第4片叶时用于农杆菌侵染。

1.2 基因克隆与生物信息学分析RNA提取与cDNA合成参照本课题组已发表的方法[13-14]。基于梨参考基因组的序列信息(http://peargenome.njau.edu.cn),设计PpPRR5b基因上下游引物(F:5’-ATGGCTATGGCGAACAAATAC-3’;R:5’-TCAGTGGTCTGAATCCTGCTTG-3’)。以cDNA为模板进行PCR反应,扩增产物连接到克隆载体pTOPO-BLUNT Simple Vector后,送武汉天一华煜基因科技有限公司进行测序。

通过生物信息分析在线工具Compute pI/Mw tool (https://web.expasy.org/compute_pi/)预测PpPRR5b蛋白的相对分子量和理论等电点。利用Protscaler软件(https://web.expasy.org/protscale/)分析编码蛋白的亲疏水性,ProtParam软件(https://web.expasy.org/protparam/)计算亲水性平均系数。通过SOPMA(https://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)对蛋白的二级结构进行预测。利用在线软件PSORT Ⅱ Prediction (https://psort.hgc.jp/form2.html)预测蛋白在细胞中的定位。运用Clustal X2软件进行氨基酸序列比对分析,并用GENEDOC软件展示比对结果。

1.3 载体构建与烟草瞬时转化利用Gateway技术构建超量表达载体。以测序正确的PpPRR5b质粒为模板,通过2轮PCR反应获得预期的电泳条带,回收PCR产物进行BP反应。由大肠杆菌感受态细胞DH5α转化,经过菌液PCR鉴定筛选阳性克隆。抽提阳性克隆质粒,通过LR反应转化到pHEX2表达载体上。进一步由大肠杆菌感受态细胞转化后进行菌液PCR,阳性克隆进行测序验证。

将已构建成功的pHEX2-PpPRR5b表达载体以及对照质粒pHEX2(含有GUS基因)分别转入农杆菌GV3101中,于LB液体培养基中活化培养。收集菌体后,采用渗透液(0.5 mol·L-1MgCl2· 6H2O + 1 mol · L-1乙酰丁香酮)重新悬浮菌体至OD600值约为0.5。静置2～4 h,注射烟草叶片背面。每个处理接种15片烟草叶作为生物学重复(n=15)。

1.4 净光合速率表型检测转化后的烟草置于三色光气候箱(红光波长615～650 nm,绿光495～530 nm,蓝光450～480 nm)培养3 d。其中,蓝光[(50±5) μmol·m-2·s-1]和绿光[(50±1) μmol·m-2· s-1]强度为定值,红光强度为变量(逐渐升高,光谱检测仪检测变化范围为45～120 μmol·m-2·s-1)。农杆菌侵染后第3天,使用CIRAS-3光合作用测定仪(PP Systems公司,USA)检测烟草叶片的光合速率、气孔导度和胞间CO2浓度。运用IBM SPSS Statistics 19软件的Student’s t test法对试验结果进行差异显著性分析,显著性水平α=0.01。

2 结果与分析

2.1PpPRR5b克隆与生物信息学分析对PpPRR5b基因进行PCR扩增,PpPRR5b的cDNA序列全长序列为2 019 bp,编码一个含有672个氨基酸的蛋白质。比对分析发现,PpPRR5b与PpPRR5a和AtPRR5的序列相似性分别为88.56%和39.80%,它们在N端和C端分别有保守的REC结构域和CCT结构域(见图1)。PpPRR5b相对分子量为74.23 kD,理论等电点为6.28。对PpPRR5b进一步分析,发现其亲水性氨基酸较疏水性氨基酸多,总亲水性平均系数为-0.743,表明该蛋白具有很强的亲水性(见图2A)。PpPRR5b二级结构预测结果表明,该蛋白二级结构主要以无规卷曲为主,有410个氨基酸(占60.01%);其余,α螺旋有191个氨基酸(占28.42%),延伸链有56个氨基酸(占8.33%),β转角有15个氨基酸(占2.23%)(见图2B)。亚细胞定位预测结果显示,PpPRR5b主要定位在细胞核中的可能性约占56.5%,推测其很可能定位于细胞核。

注:方框分别标识了两个相对保守的结构域,即REC结构域(pseudo-receiver domain)和CCT结构域。图1 PpPRR5b与PpPRR5a和AtPRR5序列比对

2.2PpPRR5b表达载体的构建BP反应催化PpPRR5b与pDONR221载体发生重组(见图3A)。通过LR反应使测序正确的pDONR221-PpPRR5b质粒与pHEX2载体发生重组,转化到大肠杆菌中并进行菌液鉴定(见图3B)。结果显示,BP和LR反应的PCR产物约为2 000 bp,与预期大小相符,条带清晰可见;阳性克隆经测序验证,证实瞬时表达载体pHEX2-PpPRR5b构建成功。

注:(A)pDONR221-PpPRR5b载体鉴定结果。(B)pHEX2-PpPRR5b载体鉴定结果。M:DNA Marker,图A的1-4泳道和图B的1-8泳道分别代表了PpPRR5b在BP和LR反应后的菌液PCR结果。图3 PpPRR5b超表达载体构建

2.3PpPRR5b瞬时表达的光合效应前期转录组研究和表达分析结果表明,PpPRR5b能够响应光质信号,并且与梨树光合作用水平表型密切相关[14-15]。此外,考虑到拟南芥同源基因AtPRR5也被报道响应红光信号,以及红光是光合作用重要光谱波段的事实[12,16-17],进一步在烟草叶片中瞬时超量表达PpPRR5b基因,检测在红光诱导条件下其对光合特性的影响。结果表明,随红光强度的增强,PpPRR5b瞬时超量表达叶片组(n=15)和空载对照系(n=15)在净光合速率、气孔导度及胞间CO2浓度水平等生理指标上均呈现出上下波动的变化特点,并且在PpPRR5b瞬时超量表达叶片组中上述生理指标的总体平均(每组样本的各生理指标在红光范围内随机选取15个进行测定比较,算其平均值进行比较)水平极显著地低于对照系(见图4),表明PpPRR5b在响应红光诱导的过程中发挥负调控光合作用的功能。

注:A为净光合速率,B为气孔导度,C为胞间CO2浓度。PpPRR5b为叶组织中瞬时表达PpPRR5b基因,GUS为空载对照。平均值是基于15个生物学重复计算获得,两个星号表示p<0.01差异显著性,三个星号表示p<0.001差异显著性。图4 红光增强条件下在烟草中瞬时表达PpPRR5b基因的光合作用表现分析

3 讨论与结论

梨树光合作用水平是影响果实产量和品质的关键因素,然而光合作用调控机制仍不清楚。树体冠层结构影响到了光照的渗透与分布,进而对光合作用水平产生影响[13]。研究表明,在郁闭冠层环境下红光和蓝光水平显著地降低[18-19]。生物钟基因是植物适应外界光照等环境变化,长期进化出来的一种内在调控机制。拟南芥生物钟基因AtPRR5能够在红光条件下抑制下胚轴的延长[11],“红光或远红光信号途径”也被发现是AtPRR5直接靶基因富集的类别[8],这说明了AtPRR5具有响应红光信号的特性。系统发育树分析表明,梨PpPRR5a和PpPRR5b基因是拟南芥AtPRR5同源基因[15]。转录组分析发现,这两个同源基因参与到了梨树光合作用的调控中[14]。PpPRR5a和PpPRR5b在红光诱导条件下表现出明显上下波动的表达变化模式,说明其表达水平也受到红光信号的调控[15]。AtPRR5响应红光的特性也支持了PpPRR5基因在红光信号诱导过程中可能发挥重要功能的假设。尽管PRR基因已被证实是植物昼夜节律的关键调控者,但是PRR基因在其他光依赖农艺性状中的调控作用仍需进一步研究揭示。红光是光合作用的重要光谱区段,其在不同冠层条件下会发生显著变化[17]。PpPRR5a已被证实在红光诱导情况下具有抑制光合作用的功能,但是PpPRR5b的功能还未解析。本研究克隆了PpPRR5b基因,在烟草叶片中瞬时表达的结果显示PpPRR5b能显著抑制净光合速率、气孔导度及胞间CO2浓度水平,证明PpPRR5b是光合作用的一个负调控因子。

本研究克隆了梨PpPRR5基因并对其功能进行了初步分析,发现其和PpPRR5a具有相似的抑制光合作用的功能。后续可进一步探究多个梨PpPRR基因是否能够形成协同的调控网络,以及它们是不是通过与其他蛋白互作的方式在调控光合作用发挥功能。这将为今后利用分子育种手段培育耐郁闭梨树种质资源提供一定参考。