响应面法优化瓜蒌皮中粗多糖提取工艺

吴 翔，徐雅芫，魏秀兰尤逢惠

（1. 安徽省农业科学院农产品加工研究所，安徽 合肥 230036；2. 安徽黑娃食品生物科技有限公司，安徽 涡阳 233600）

亳州种植瓜蒌历史悠久，曾是瓜蒌的主产地，这里产的天花粉被称为“亳花粉”，是《中国药典》中以“亳”字命名的中药材之一，亳州地产药材[1]。瓜蒌（Trichosanthes kirilowii），又称栝楼，葫芦科，属多年生攀缘草本植物[2]。瓜蒌浑身是宝，皮、瓤、籽和根可以做中药材，有清肺化痰、止咳平喘、润肠通便等功效[3]。瓜蒌皮煎剂有较好的抑菌作用，研究表明对痢疾杆菌、肺炎球菌、溶血性链球菌及白喉杆菌均有效果[4]；对小白鼠免疫功能的提高效果明显[5]。多个单糖分子缩合、失水即是多糖，糖类物质分子结构既复杂又庞大。多糖是构成生命的四大基本物质之一，大量存在于植物、微生物的细胞壁及动物细胞膜中，具有免疫调节、抗病毒和抗癌、降血糖、抗衰老、抗氧化、抗溃疡，调节身体免疫力等多种作用[6]。以提高瓜蒌皮粗多糖的得率目标，采用Box-behnken 中心组合设计原理优化提取工艺，为瓜蒌高值化、综合利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

瓜蒌皮，安徽黑娃食品生物科技有限公司提供，产地为该公司基地，品种为皖蒌9 号；标准右旋葡萄糖，阿拉丁公司提供；无水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸，均为国产试剂（分析纯）；水，均为蒸馏水。

1.1.2 仪器与设备

UV-2800 型紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司产品；RE-2000A 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品；DD-5M 型低速大容量离心机，湖南湘立科学仪器有限公司产品；FD-1D-50 型冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司产品；HH-4 型数显恒温水浴锅，上海力辰邦西仪器科技有限公司产品；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂产品；JJ124BC 型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂产品；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 瓜蒌皮粗多糖的提取

瓜蒌皮粗多糖提取采用水体醇沉法[7]，提取工艺为瓜蒌皮→洗净→烘干→粉碎→提取→过滤→离心→浓缩→醇沉→过滤→冻干→粗多糖。

1.2.2 葡萄糖标准曲线绘制

分别精确吸取葡萄糖对照品溶液各0.2，0.6，1.0，1.4，1.8 mL，置于10 mL 容量瓶中，再加入50 g/L苯酚溶液0.5 mL 和浓硫酸溶液1.5 mL，置水浴（100 ℃） 保温10 min，取出，室温下放置冷却，加蒸馏水至刻度。于波长490 nm 处测定吸光度（A），以质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，空白对照为蒸馏水。

1.2.3 瓜蒌皮粗多糖含量测定

采用苯酚- 硫酸比色法，对照品为葡萄糖，于波长490 nm 处测定多糖含量，该测定方法操作简单、重复性好、结果准确可靠[8]。

准确称取瓜蒌皮粗多糖样品适量，用适量蒸馏水溶解于10 mL 容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度。准确吸取上述溶液1 mL 置于100 mL 容量瓶中加适量蒸馏水至刻度，制成约50 μg/mL 供试品溶液，即得。

1.2.4 单因素试验

（1） 提取温度对瓜蒌皮得率的影响。准确称取瓜蒌皮50.00 g，采用料液比1∶20，提取时间2.5 h。分别在提取温度50，60，70，80，90 ℃水浴下提取。用乙醇醇沉至含醇量为80%，静置过夜后过滤取沉淀，冷冻干燥后得瓜蒌皮粗多糖，考查瓜蒌皮粗多糖得率。

（2） 提取时间对瓜蒌皮得率的影响。准确称取瓜蒌皮50.00 g，采用料液比1∶20，提取温度50 ℃。分别水浴提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h。用乙醇醇沉至含醇量为80%，静置过夜后过滤取沉淀，冷冻干燥后得瓜蒌皮粗多糖，考查瓜蒌皮粗多糖得率。

（3） 料液比对瓜蒌皮得率的影响。准确称取瓜蒌皮50.00 g，采用提取温度50 ℃，提取时间2.5 h。分别采用料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 进行水浴。用乙醇醇沉至含醇量为80%，静置过夜后过滤取沉淀，冷冻干燥后得瓜蒌皮粗多糖，考查瓜蒌皮粗多糖得率。

1.2.5 响应面法试验设计安排

在单因素试验结果基础上，根据Box-behnken中心组合设计原理，选取提取温度（A）、提取时间（B） 和料液比（C） 3 个因素为自变量，以瓜蒌皮粗多糖得率为响应值，进行三因素三水平响应面优化组合。

响应面优化试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面优化试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

于波长490 nm 处吸光度对葡萄糖质量浓度进行回归处理，绘制出葡萄糖标准曲线，并由此得到回归方程为Y=100.05X-0.003 3，R2=0.999 1。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取温度对瓜蒌皮粗多糖得率的影响

提取温度对粗多糖得率的影响见图2。

图2 提取温度对粗多糖得率的影响

由图2 可知，提取温度为50～90 ℃时，瓜蒌皮粗多糖得率先随着温度的升高而升高；当温度升高到70 ℃时得率达到最高值，此后，得率随温度的升高反而降低。提取温度的升高加速了瓜蒌皮中多糖的溶出，但当温度升高至一定范围内，瓜蒌皮中大量的其他物质也随之溶出，导致溶液黏度增大，多糖溶出困难。当提取温度过高时，部分糖苷键会发生断裂而导致多糖变性。因此，当提取的其他条件一样时，瓜蒌皮粗多糖提取的最适温度为70 ℃。综合考虑，选取60～80 ℃进行优化试验。

2.2.2 提取时间对瓜蒌皮粗多糖得率的影响

提取时间对粗多糖得率的影响见图3。

图3 提取时间对粗多糖得率的影响

由图3 可知，当提取时间为0.5～2.5 h 时，提取时间的增长先会使瓜蒌皮粗多糖得率升高；在提取时间为2.5 h 时得率最高，之后提取时间增长反而使瓜蒌皮粗多糖提取率开始下降。发生这一变化的主要原因是提取时间过长时多糖发生分解变性；此外，溶液中的杂质也越来越多，溶液黏度过大而不利于多糖溶出。故当提取的其他条件一样时，瓜蒌皮粗多糖提取的最佳时间为2.5 h。综合考虑，选取2.0～3.0 h进行优化试验。

2.2.3 料液比对瓜蒌皮粗多糖得率的影响

料液比对粗多糖得率的影响见图4。

图4 料液比对粗多糖得率的影响

由图4 可知，提取过程中随着料液比的增大，瓜蒌皮粗多糖得率逐渐提高，当料液比为1∶25 时得率最高，料液比大于1∶25 时，瓜蒌皮粗多糖得率逐渐降低。可能是由于原料用量一定时，提取液量大时多糖比较容易从原料中溶出，从而使得得率升高。当提取液用量增大到一定程度时，相对质量浓度差增大率越来越低，对多糖得率的影响也越来越小。此外，考虑到溶剂用量越大杂质越多，生产成本越高，瓜蒌皮粗多糖提取的最佳料液比为1∶25。综合考虑，选取料液比1∶20 ～1∶30 进行优化试验。

2.3 试验模型的建立

根据单因素试验确定单因素最佳水平，依表1进行3 个因素（提取温度、提取时间、料液比） 与瓜蒌粗多糖得率之间的三因素三水平响应面法分析试验，一共有17 个试验点。

响应面试验及结果见表2。

表2 响应面试验及结果

2.4 模型方差分析

将表中数据通过Design Expert 8.06 软件进行二次多元回归拟合，以编码自变量提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C） 拟合出以粗多糖得率（Y） 为考查指标的二次多项回归方程：

响应面各因素效应的方差分析见表3。

根据方差分析结果，上述回归模型中F=111.53，p＜0.000 1，表明试验所采用的回归模型差异极显著；失拟项p 为0.68＞0.05，对模型是有利的，无失拟因素存在，该回归方程可靠；回归系数R2=0.993 1，大于85%，说明该回归方程拟合程度好，可用该方程代替试验真实点来描述各变量与响应值之间的关系。校正系数R2Adj=0.984 2，说明该模型可解释98.42%粗多糖提取率的变化。表中数据说明试验设计可靠，误差小，符合实际情况[9-11]，故该回归方程是瓜蒌皮粗多糖得率与提取工艺各参数拟合的较为合适数学模型。

由表3 可知，一次项A，B，C，二次项A2，B2，C2的p 值均小于0.01，说明A，B，C 和A2，B2，C2对粗多糖得率影响均极显著；交互项AB，AC，BC的p 值均大于0.05，说明交互项对粗多糖得率影响均不显著。根据表中F 值可得到3 个因素对粗多糖提取率影响程度为提取时间（B） ＞料液比（C） ＞提取温度（A）。

2.5 响应面分析试验结果

提取温度与提取时间对多糖得率的交互影响见图5，提取温度与料液比对多糖得率的交互影响见图6，提取时间与料液比对多糖得率的交互影响见图7。

图5 提取温度与提取时间对多糖得率的交互影响

图6 提取温度与料液比对多糖得率的交互影响

图7 提取时间与料液比对多糖得率的交互影响

通过Design Expert 8.06 软件分析，结合回归模型方差分析的结果，依据二次多项回归方程式得出不同因子的响应面分析图及响应等高线图，就可观察得出反映两变量与因变量的关系，曲面坡度的陡峭程度，等高线的密集程度，可反映该试验中的因变量对响应面的影响程度。若曲面坡度越平缓，则影响越小。等高线越接近椭圆形，2 个因素的交互作用越强；若等高线趋于圆形，则两变量的交互作用几乎可以忽略[12]。由图5 ～图7 比较可知，AC（即提取温度和料液比） 的交互作用对瓜蒌皮粗多糖得率影响最大，BC（即提取时间和料液比） 的交互作用对得率影响次之，AB（即提取温度和提取时间）的交互作用影响不显著。

固定其中一个因素，考查另外2 个因素对响应值的影响。由图5 可知，在料液比一定的情况下，随着提取时间（B） 和提取温度（A） 的增加，瓜蒌皮粗多糖得率均呈现出先升高再降低的变化趋势。在提取温度（A） 是66.8～74.4 ℃，提取时间（B）是2.3～2.9 h 时，瓜蒌皮粗多糖的得率在较高的范围内。由图6 可知，在提取时间（B） 一定的情况下，随着提取温度（A） 和料液比（C） 的增高，瓜蒌皮粗多糖得率呈现出先升高后降低的变化趋势。在提取温度（A） 是66.9～74.3 ℃，料液比（C） 是1∶22 ～1∶30 时，瓜蒌皮粗多糖得率相对较高。由图7 可知，在提取温度（A） 一定的情况下，随着提取时间（B）和料液比（C） 的增加，瓜蒌皮粗多糖得率呈现先升高后降低的变化趋势。当提取时间为2.3～2.9 h，料液比为1∶22 ～1∶30 时，瓜蒌皮粗多糖得率处于较高水平。

2.6 验证试验

采用Design Expert 8.06 软件对二次多项回归方程式进行求解，得到最佳的瓜蒌皮粗多糖提取条件为提取温度（A） 70.52 ℃，提取时间（B） 2.62 h，料液比（C） 1∶26.45，此条件下，预测瓜蒌皮粗多糖得率为3.1449 5%。综合考虑实际的操作可行性，并根据实验室条件，将提取条件修正为提取温度70 ℃，提取时间2.6 h，料液比1∶26，重复试验3 次，此时瓜蒌皮粗多糖得率为3.11%，同模型预测值的相对误差值为1.11%（＜5%），试验结果与预测值基本符合。由此可知，响应面法所预测的瓜蒌皮粗多糖提取条件参数准确可靠，在实际应用中具有一定的价值[13]。

3 结论

通过单因素试验确定试验的因素和水平，采用Box-behnken 中心组合设计方法设计响应面试验优化确定了瓜蒌皮粗多糖的最优提取工艺为提取温度70 ℃，提取时间2.6 h，料液比1∶26，在此条件下瓜蒌皮粗多糖得率为3.11%。可为瓜蒌皮提取粗多糖的工艺研究提供一定的数据支持，为下一步提纯多糖和其他理化检测奠定了基础。