C1q类似蛋白4在乳腺癌中的表达及生存分析

张 庆, 方昊天, 李青山, 徐 繁

(承德医学院附属医院肿瘤科, 河北 承德 067000)

乳腺癌是全球威胁女性健康最严重的恶性肿瘤,在中国就有约12万中国女性死于乳腺癌[1-2],发现新的更敏感的生物标志物对乳腺癌患者的预后至关重要。C1q类似蛋白4(C1q-like protein 4,C1ql4),是C1q和肿瘤坏死因子(TNF)相关蛋白(CTRPs) 家族的主要成员之一,也是脂肪来源的分泌蛋白,在睾丸和脂肪组织中高度表达。Clq14在促进血管生成、抑制脂肪生成、拮抗肌母细胞融合、促进睾酮合成和分泌等方面发挥着十分重要的作用[3-4]。血管生成在恶性肿瘤的发生、发展过程中起着极其重要的作用[5]。因此,抗血管生成可以破坏预先存在的血管并避免新血管形成,使肿瘤血管系统正常化,减少肿瘤细胞氧气供应和营养支持,进而抑制肿瘤生长。目前尚无C1ql4在乳腺癌中表达情况的相关研究。本研究检测乳腺癌组织中C1ql4的表达情况,并分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取承德医学院附属医院2016年1月至2017年7月术后病理明确诊断为乳腺癌的143例患者为研究对象。纳入标准:①患者均于承德医学院附属医院进行改良根治术或乳腺区段切除术;②经术后病理确诊,有完整的病理学资料;③术前均未行放、化疗或内分泌治疗。排除标准:①伴有第二原发恶性肿瘤疾病;②伴有严重免疫缺陷疾病;③伴有心、脑、肺、肾等脏器的重大疾病;④伴有严重代谢性疾病。患者平均年龄51.94±9.81岁,中位年龄51岁(26-81岁)。总生存期计算为手术日期至患者死亡或最后一次随访日期。末次随访时间为2022年6月。其中死亡27例。采集患者临床资料,包括患者年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期、分子分型和生存期等。同时收集明确诊断为乳腺纤维腺瘤患者的手术后组织标本20例作为对照组。基于AJCC2017版本标准进行TNM分期。本研究均取得患者知情同意。研究方案经承德医学院医学伦理委员会批准(伦理批号:LL2021048)。

1.2免疫组织化学染色检测组织C1ql4表达水平:切片60℃烤箱烘片2h后取出,二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡10min。水化,PBS 3min×3次。微波炉高温柠檬酸盐抗原修复,PBS漂洗5min×3次。按照通用SP试剂盒说明进行操作。一抗(稀释比例1∶200),4℃孵育过夜。二抗37℃孵育30min,根据DAB显色试剂盒说明显色,苏木精染液复染,1%盐酸酒精分化液分化,脱水、透明、封片,镜检拍照留存。结果判定:C1ql4阳性染色主要分布在细胞质中,在细胞核中表达较少。参考以往研究中所应用的免疫组化评分系统,采用半定量积分法评估结果,每张切片随机选取5个高倍视野,按照阳性细胞百分比及染色强度进行评分,具体如下:①阳性细胞百分比:0分(<5%),1分(5%～25%),2分(26%～50%),3分(51%～75%),4分(76%～100%);②染色强度:0分(阴性),1分(弱阳性,淡黄色),2分(中等阳性,黄色),3分(强阳性,棕褐色),两项分数相乘得到最终评分,0分为阴性(-),1～4分为弱阳性(+),5～8分为阳性(++),9～12分为强阳性(+++)。1分及以上均为阳性,其中1～8分为低表达,>8分为高表达[6]。

2 结 果

2.1C1ql4在乳腺癌和乳腺纤维腺瘤中的表达:免疫组化结果显示C1ql4的免疫阳性反应主要位于乳腺癌组织的细胞质中,细胞核中有少量分布。根据半定量评分标准,将C1ql4在组织中的表达划分为高表达组和低表达组。在乳腺纤维腺瘤中,C1ql4蛋白阳性表达率为15%(3/20),且均为低表达(见图1);而在乳腺癌组织中C1ql4蛋白阳性率为98.6%(141/143)(见图2)。与乳腺纤维腺瘤相比,C1ql4在癌组织中的表达明显增强(P<0.001),见图3。

图1 C1ql4在乳腺纤维腺瘤组织中的表达情况(放大倍数200)

图2 C1ql4在乳腺癌组织中的表达情况(放大倍数200)

2.2不同病理特征乳腺癌患者的C1ql4表达水平比较:分析结果显示,C1ql4高表达与瘤体直径、淋巴结转移、TNM分期、分子分型相关,而与年龄、ER状态、PR状态、Her-2状态、Ki67无明显相关性(见表1)。

表1 乳腺癌组织中C1ql4表达与临床病理指标之间的关系n(%)

2.3C1ql4蛋白表达与乳腺癌患者预后的关系:在本研究中,27例患者(18.9%)在随访期间死于乳腺癌恶化,死亡患者的中位生存时间仅为43.0个月,生存期范围为10.0-58.0个月。生存分析显示,1、3、5年生存率分别为99.3%、94.4%、81.1%。C1ql4高表达组的生存预后相比低表达组患者较差(log-rank检验χ2=11.953,P=0.001),见图4。

图4 C1ql4表达与乳腺癌患者的预后

2.4影响乳腺癌患者OS的单因素及多因素分析:单因素分析显示,淋巴结转移、肿瘤TNM分期、ER状态、PR状态、分子分型以及C1ql4的表达量与乳腺癌患者的总生存相关(见表2)。多因素Cox回归分析显示,肿瘤的TNM分期、分子分型以及C1ql4的表达量是乳腺癌患者总生存的独立预后因素(见表3)。

表2 赋值情况

表3 影响乳腺癌患者OS的单因素和多因素COX回归分析

3 讨 论

乳腺癌复发转移后治疗效果欠佳,耐药及治疗副反应严重影响患者的预后,威胁患者的生命[7]。因此,寻找新的治疗靶点对乳腺癌的诊治至关重要。肿瘤的生长与血管生成密切相关,乳腺癌的异常增殖和转移依赖于新血管的不断生成[8]。C1ql4通过激活ERK1/2信号通路刺激血管新生。C1ql4的促血管生成作用将可能为缺血性损伤的血管修复、组织器官再生及伤口愈合提供一种新的治疗思路;同时也可能为肿瘤的抗血管生成治疗提供新的干扰靶点。本研究结果表明C1ql4蛋白表达在乳腺癌恶性发展的过程中呈上升趋势,提示高表达的C1ql4蛋白可能在乳腺癌的发展过程中发挥促进作用。通过对C1ql4和临床病理资料的分析,我们发现发病年龄<40岁、肿瘤直径>2cm、淋巴结转移阳性、病理分级Ⅱ～Ⅲ级、TNM分期Ⅲ期～Ⅳ期和三阴型患者中,C1ql4蛋白高表达患者比例均超过50%,其中,C1ql4的表达与乳腺癌患者的肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期以及分子分型之间相关性具有统计学意义。上述临床病理指标是与乳腺癌预后不良相关的重要临床指标,提示C1ql4可能与乳腺癌的高危复发因素和恶性程度存在相关性,由此我们推测C1ql4可能促进了乳腺癌复发转移的进展。生存分析表明,C1ql4高表达的乳腺癌患者,其生存时间明显短于C1ql4蛋白低表达的患者,表明C1ql4高表达对乳腺癌具有促进作用。

目前关于C1ql4及其相关作用机制在肿瘤,特别是在乳腺癌的发生发展中的作用尚不清楚。C1ql4可能通过调节血管新生、肿瘤微环境、雌激素水平和脂肪代谢进而影响乳腺癌的发生发展。但有关此方面的研究较少,其具体机制有待深入研究。综上,本研究检测了C1ql4在乳腺癌组织中的表达情况并分析了C1ql4的表达量与乳腺癌患者生存预后的关系,发现C1ql4在乳腺癌中表达水平升高,C1ql4高表达与患者预后不良相关,可能成为乳腺癌的生物标志物和潜在治疗靶点。未来需要开展更多的基础研究和临床研究,进一步探讨C1ql4在乳腺癌中的作用及机制。