茯苓四逆汤抑制TLR4/NF-κB通路改善慢性心衰大鼠心功能

张 梦, 李晶晶, 樊光辉

(1.湖北中医药大学/华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院, 湖北 武汉 430000 2.湖北省武汉市第五医院, 湖北 武汉 430000 3.湖北中医药大学/深圳大学附属华南医院, 广州 深圳 518111)

慢性心力衰竭(简称心衰)是由心脏结构或功能损害引起的心室充盈和/或射血功能障碍所致,以呼吸困难、乏力等为主要表现,是大多数心血管疾病发展的最终阶段[1]。目前临床上常用强心剂、利尿剂等西药及心脏移植、介入手术等非药物治疗方式治疗慢性心衰,但均存在一定局限性[2]。近年,中医药治疗慢性心衰获得比较满意效果。临床研究发现,茯苓四逆汤治疗慢性心衰的有效性及安全性均较高[3]。但茯苓四逆汤在慢性心衰中的作用机制尚不清楚。Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路激活可引发心肌炎症,导致心肌细胞凋亡和心肌病理损伤[4]。茯苓四逆汤通过抑制TLR4/NF-κB通路减轻脓毒症大鼠心肌损伤[5]。本研究旨在探讨茯苓四逆汤对慢性心衰大鼠心功能的影响以及TLR4/NF-κB通路在此过程中的作用,以期为慢性心衰的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物:72只SPF级雄性SD大鼠(体质量180～220g)购自武汉大学动物实验中心【生产许可:SCXK(鄂)2019-0004】。本实验严格遵循3R原则。

1.2药物与试剂:茯苓四逆汤由茯苓、附子、人参、炙甘草、干姜5味中药(张仲景大药房)组成,中药煎煮2次后合并,浓缩成水煎剂(生药浓度3.6g/mL),备用;卡托普利(浙江瑞新药业股份有限公司,批准文号:国药准字H33021130);注射用盐酸多柔比星(阿霉素)(深圳万乐药业有限公司,批准文号:国药准字H44024359)。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6 ELISA试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司,货号:ER1393、ER1094、ER0042);TUNEL凋亡检测试剂盒(江西艾博因生物科技有限公司,货号:IBO2707G);TLR4、GAPDH抗体(美国abcam公司,货号:ab217274、ab22555);p-NF-κB、NF-κB抗体(美国Invitrogen公司,货号:PA5-118566、PA5-27617);核因子κB抑制蛋白α(IκBα)、p-IκBα抗体(北京百奥莱博科技有限公司,货号:K18362-ZKS、K21377-FJR)。

1.3主要仪器:宠羡动物用便携式彩色多普勒超声诊断仪(南京云石医疗科技有限公司);Sunrise酶标仪(上海帝肯贸易有限公司);E100光学显微镜(日本尼康公司);ZF-268型全自动凝胶成像分析系统(上海金鹏分析仪器有限公司)。

1.4造模、分组及给药:采用腹腔注射阿霉素法复制慢性心衰大鼠模型:阿霉素注射剂量第1、3、9、11、13和15天为1mg/kg,第5和7天为2mg/kg,注射体积为1mL。12只腹腔注射等体积生理盐水大鼠作为对照组。末次注射一周后,使用超声测量心功能指标:左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)。根据大鼠一般行为体征(体重下降、精神萎靡等)和心功能指标(LVEF<60%)判断造模成功与否。造模成功大鼠随机分为模型组、茯苓四逆汤低、中、高剂量组和卡托普利组。给药剂量根据人和大鼠等效剂量换算公式计算,200g大鼠茯苓四逆汤等效剂量折算为6g/kg,卡托普利等效剂量折算为2.25mg/kg。茯苓四逆汤低、中、高剂量组分别给予茯苓四逆汤等效剂量的1、2、3倍(6g/kg、12g/kg、18g/kg);卡托普利组给予卡托普利2.25mg/kg;模型组和对照组给予等体积蒸馏水。1次/d,2mL/次,连续灌胃4周。

1.5超声心电图检测心功能指标:给药结束后,麻醉大鼠并呈仰卧位固定在操作台上,将彩色多普勒超声诊断仪的探头置于左胸前,使用二维超声心动图显示左心室的长轴,获取LVEF、LVFS、LVESD、LVEDD。

1.6ELISA法检测血清炎性因子水平:超声检查结束后,腹主动脉取血5mL,离心分离血清,参照ELISA试剂盒说明操作,获取光密度值。根据标准曲线计算血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.7HE染色观察心肌组织病理学改变:取血后迅速摘取心脏,PBS洗涤后一部分心肌组织置于4%多聚甲醛中固定,另一部分置于-80℃保存。固定24h后的心肌组织进行常规脱水、浸蜡、包埋以及切片(4μm);将切片脱蜡、水合后依次放入苏木素和伊红染液中;光学显微镜观察大鼠心肌组织病理学改变。

1.8TUNEL染色观察心肌细胞凋亡率:将切片进行脱蜡、水合后添加TdT酶反应液37℃孵育1h;添加荧光标记液避光孵育20min;DAPI染核;光学显微镜观察并拍照,随机选取5个视野计数凋亡细胞(绿色荧光),计算凋亡率。

1.9Western blot检测心肌组织中TLR4/NF-κB通路蛋白表达:取出-80℃保存的心肌组织,添加RIPA裂解液充分裂解以获取总蛋白;将各样品蛋白浓度调整一致,蛋白变性后每泳道上样20μg进行SDS-PAGE电泳;切胶后转至PVDF膜,5% BSA对膜封闭2h;添加一抗(1∶1000稀释)4℃孵育过夜,洗涤后添加二抗(1∶5000稀释);化学发光试剂显色。分析蛋白条带灰度(Image J软件),GAPDH为内参蛋白。

2 结 果

2.1茯苓四逆汤对慢性心衰大鼠心功能的影响:与对照组比较,模型组大鼠LVEF、LVFS降低,LVESD、LVEDD升高(P<0.05);与模型组比较,茯苓四逆汤低、中、高剂量组和卡托普利组大鼠LVEF、LVFS升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠LVEF LVFS LVESD LVEDD比较

2.2茯苓四逆汤对慢性心衰大鼠心肌损伤的影响:HE染色显示,对照组大鼠心肌无明显异常;模型组大鼠心肌纤维排列不规则且明显断裂,细胞核皱缩、水肿,存在大量炎性细胞浸润;茯苓四逆汤低、中、高剂量组和卡托普利组大鼠心肌纤维呈不规则排列,但仅部分出现断裂和细胞水肿、坏死,存在少量炎性细胞浸润,且随着茯苓四逆汤剂量增加,心肌损伤程度逐渐减轻。见图1。TUNEL染色显示,对照组大鼠心肌组织中几乎看不到呈绿色荧光的细胞;模型组可见大量呈绿色荧光细胞,心肌细胞凋亡率高于对照组(P<0.05);茯苓四逆汤低、中、高剂量组和卡托普利组可见少量呈绿色荧光的细胞,心肌细胞凋亡率低于模型组(P<0.05),见图2、表2。

图1 各组大鼠心肌组织病理学改变(HE染色,×400)

图2 各组大鼠心肌组织中细胞凋亡情况(TUNEL染色,×200)

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较

2.3茯苓四逆汤对慢性心衰大鼠血清炎性因子的影响:模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平高于对照组(P<0.05);而与模型组比较,茯苓四逆汤低、中、高剂量组和卡托普利组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清TNF-α IL-1β IL-6水平比较

2.4茯苓四逆汤对慢性心衰大鼠心肌组织中TLR4/NF-κB通路蛋白表达的影响:模型组大鼠心肌组织中TLR4、p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα蛋白表达水平高于对照组(P<0.05);而与模型组比较,茯苓四逆汤低、中、高剂量组和卡托普利组大鼠心肌组织中上述蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图3、表4。

图3 各组大鼠心肌组织中TLR4、p-NF-κB、NF-κB、p-IκBα、IκBα蛋白表达

表4 各组大鼠心肌组织中TLR4 p-NF-κB/NF-κB p-IκBα/IκBα蛋白表达水平比较

3 讨 论

中医认为心衰主要是由于气血亏虚、心气不足、心体损伤等所致,属于怔忡、心悸、痰饮、喘症、水肿、心水等范畴。心功能异常及心肌损伤是慢性心衰的主要病理体现,具体表现为心室收缩和舒张功能障碍、射血分数降低以及心肌细胞过度凋亡等[6-7]。本研究中模型大鼠LVEF、LVFS降低,LVESD、LVEDD以及心肌细胞凋亡率升高,且心肌组织出现明显病理损伤。提示本研究成功复制了慢性心衰大鼠模型,可用于药物治疗效果的研究。

中医药以“权衡缓急,补虚泻实”为慢性心衰的治疗原则。茯苓四逆汤是一种中药方剂,出自《伤寒论》,由四逆汤加茯苓、人参组成,具有回阳益阴之功效。茯苓四逆汤方中茯苓健脾利水消肿且能安神除燥;人参益气生津养阴;干姜辛热,回阳通脉,温阳守中,与附子、炙甘草合用能够增强回阳救逆、益气固脱之功。本研究使用茯苓四逆汤治疗后,慢性心衰大鼠LVEF、LVFS升高,LVESD、LVEDD以及心肌细胞凋亡率降低,且心肌组织病理损伤程度有所减轻,与阳性药物卡托普利的作用效果一致。提示茯苓四逆汤能够有效改善慢性心衰大鼠心功能及心肌损伤。以上结果表明,茯苓四逆汤对慢性心衰具有较好的治疗效果,但其作用机制仍有待进一步明确。

炎症是慢性心衰的发病机制之一,且炎症相关细胞因子常作为慢性心衰的治疗靶点[8-9]。本研究中,慢性心衰大鼠血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高,且心肌组织中存在大量炎性细胞浸润,提示慢性心衰大鼠除存在心肌炎症外,还存在全身炎症。而茯苓四逆汤可降低慢性心衰大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平,且改善心肌组织中炎性细胞浸润,提示茯苓四逆汤能够减轻慢性心衰大鼠的局部和全身炎症反应。TLR4是心肌组织中分泌最多的TLR蛋白,在心肌炎症中起关键作用,TLR4激活能够导致NF-κB从细胞质转移到细胞核,同时诱导NF-κB和IκBα磷酸化,从而促进炎性因子合成与释放,引发炎症[10]。本研究中,茯苓四逆汤减轻了慢性心衰大鼠心肌组织中TLR4、p-NF-κB/NF-κB、p-IκBα/IκBα蛋白表达水平的上调,提示茯苓四逆汤可能通过抑制TLR4/NF-κB通路激活降低慢性心衰大鼠中炎症反应。

综上所述,茯苓四逆汤能够抑制TLR4/NF-κB通路激活,减轻慢性心衰大鼠心肌损伤,改善心功能,为临床中医药治疗慢性心衰提供了一定的理论依据。