丝素蛋白载药纳米粒的研究进展

张子凡, 李鹏飞, 王建南, 许建梅

(1.苏州大学 纺织与服装工程学院, 江苏 苏州 215021; 2.苏州大学 纺织行业医疗健康用蚕丝制品重点实验室, 江苏 苏州 215127)

药物递送系统是将活性药物以物理吸附或化学共价结合等方式分散包埋在载体材料中输送到病灶部位,实现缓慢释放或可控释放。这种方式特别适用于那些在体内生理环境下易失活而导致生物利用率降低的药物,还适用于副反应较大,易引起全身性免疫刺激的化疗类药物。药物递送系统可以是纳米粒、微球、微胶囊和乳剂等。其中,纳米载药粒子因其尺寸效应而显示出独特的性能,纳米粒子保护药物不被肝脾清除,突破人体生理屏障,直接作用于细胞、组织,提供局部组织持续的高血液浓度,增强细胞内渗透并降低患者正常细胞的毒性风险[1]。

可用作纳米粒载体材料的物质有:合成的生物可降解聚合物,如聚乳酸、聚己内酯和聚乙醇酸等;天然聚合物,如纤维素、壳聚糖、透明质酸、海藻酸盐等,以及蛋白质类高聚物,如胶原、明胶、丝素蛋白等[2]。由于丝素蛋白既有通过β折叠生成的晶体结构而形成的疏水链段,也有相对较短且非重复的亲水链段,从而导致丝素蛋白具有独特的双亲特性。此外,丝素蛋白还拥有良好的生物相容性和高免疫原性,它作为一种生物材料可被制成薄膜、三维支架、水凝胶、静电纺纤维和微球等而广泛应用于生物医学领域。特别是,其生物可降解性、良好的生物相容性、改善细胞黏附和增殖的特性、化学修饰潜力使其成为一种很有前途的药物载体材料[3]。此外,丝素蛋白具有不同功能的基团,可以对其进行多种途径的化学修饰或表面改性提高药物的负载率,通过与靶向配体的共价连接来触发对细胞的生物反应,实现靶向释药,提高治疗效率[4]。

本文分析了丝素蛋白的结构和性能,综述了丝素蛋白制备载药纳米粒子的研究进展,讨论了其不同条件下的缓控释效果,最后总结了多种方法来提高纳米粒子的制备效率,期望未来载药纳米粒子向可控释放、多功能化、人体无害化、高治疗效率方向发展。

1 丝素蛋白的结构和性能

丝素蛋白由蚕丝纤维经脱胶处理而制得,由Gly-Ala-Gly-Ala-Ser重复多肽序列组成[5]。丝素蛋白含有3个结构蛋白亚基,分别为重链(约390 ku)、 轻链(约26 ku)和小糖蛋白P25(约30 ku)。 二硫键将轻链和重链连接在一起,P25通过非共价疏水键连接到纤维上。丝素蛋白的重链具有两亲性,包含疏水和亲水链段。疏水链段具有重复的结构,通过β折叠来生成晶体结构,亲水性区域是相对较短且非重复的片段,因此,丝素蛋白被认为是一种疏水性糖蛋白,不溶于水[6],但在某些中性盐的浓溶液中可被溶解,经过透析处理去除盐即可获得再生丝素蛋白水溶液。

丝素蛋白有Silk Ⅰ和Silk Ⅱ 2种不同的二级结构形式。Silk Ⅰ以α螺旋结构为主,混合有β折叠和无规卷曲结构,呈现出亚稳定的水溶性构象。相反,Silk Ⅱ主要是反平行的β折叠构象,表现出更高的稳定性和疏水性[7]。通过乙醇等溶剂处理或在高热高剪切力的作用下,Silk Ⅰ向Silk Ⅱ转变,导致丝素产生自组装,从而形成微纳米球、微纳米颗粒和微细纤维等。

丝素蛋白作为一种天然聚合物,拥有优异的力学性能、良好的生物相容性和生物可降解性等优点。与其它合成的或天然的聚合物相比,丝素蛋白作为药物载体的制备条件温和[8],并且可通过引入不同的官能团来改变丝素分子的官能化程度,使各种不同的药物可在不同的动力学条件下被加载和释放,从而提供了广泛的可调节的药物释放系统[9]。此外,丝素具有响应pH值变化的内在能力[10],由于丝素的组成部分是各种氨基酸,因此丝素整体呈酸性,在低pH值下,丝素低于其等电点,从而显示出正电荷。由于阿霉素具有弱碱性,可通过静电作用吸附在丝素纳米粒子上,因此在中性条件下,丝素与阿霉素有较高的结合能力。而处于低pH值环境时,丝素和阿霉素直接的静电作用发生改变,从而实现药物释放且无需任何化学修饰,避免有机溶剂的使用对人体产生副作用。丝素作为一种蛋白质,其生物降解主要是通过蛋白水解酶进行的,降解产物主要为各种氨基酸,无毒无害,在体内代谢也不会产生任何副作用[11]。Min等[12]制备了一种丝素蛋白和纳米银的复合材料并用兔模型评价了丝素纳米银粒子的生物相容性,证实纳米银促进了丝素蛋白的降解且具有显著的抗菌活性,在24 h内对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑菌率均为100%。此外,在创面愈合方面,与临床使用的猪脱细胞真皮基质相比,丝素纳米银粒子具有良好的生物相容性。

2 丝素蛋白纳米粒的制备

丝素蛋白纳米粒的制备方法主要有沉淀法、盐析法、乳液法和脱溶剂法等。表1列出了丝素载药纳米粒子的制备方法、装载药物和缓释性能等。可以看出,不同制备方法所得纳米粒子的性能差别较大。与其它制备方法相比,使用盐析法和电喷雾法在制备过程中不会引入有机溶剂且对药物有较高的载药率。不同制备方法所得纳米粒子也具有不同的载药方式,导致药物的释放效果也有不同。通过包覆方式载药的纳米粒子释放效率要低于吸附载药的纳米粒子。此外,由于装载的药物不同,其载药率和释放效率以及粒子的形貌大小都会受到影响。使用不同方法制备的纳米粒子都可在制备过程中通过改变丝素蛋白溶液的浓度来控制其尺寸和产量。综上,选择合适的方法来制备丝素纳米粒子用于药物输送是非常重要的。目前丝素纳米粒子的制备仍然是一个具有挑战性的领域,需要进一步探索。丝素的高相对分子质量和蛋白质的性质使得纳米颗粒的制备难以控制。此外,当丝素暴露于热、盐、pH值变化和高剪切条件下时倾向于自组装成纤维或凝胶,从而影响纳米粒子的制备,降低制备效率[13]。图1示出几种常见的丝素纳米粒子制备方法。

图1 几种常见的丝素纳米粒子制备方法Fig.1 Several common preparation methods of silk fibroin nanoparticles.(a) Precipitation method; (b) Salting-out method; (c) Electrospray method; (d) Emulsion method; (e) Desolvent method

表1 丝素纳米粒子的制备方法Tab.1 Preparation method of silk fibroin nanoparticles

2.1 沉淀法

纳米沉淀过程分为3个主要阶段:成核、生长和聚集[29]。在纳米沉淀过程的初始阶段,丝素结构的两亲性诱导丝素链局部过饱和,从而使丝素链形成多个核且不聚集。通过丙酮溶液的添加,可获得更高的结晶度诱导丝素链重新排列,从而形成新的丝素链,使初始核开始以相似的速度增长,新的链加成可通过溶剂在丙酮相中的扩散来维持。在扩散过程中,水分子可运输溶剂化的丝素分子,使这些分子到达初始核并黏附在核表面。初始阶段内没有聚集,直到最后阶段才会发生聚集从而产生纳米粒子。在生长步骤之后,纳米粒子通过聚集体积逐渐增大,迫使纳米粒之间相互作用并分散,这可能是因为在相同体积内纳米粒子尺寸增大导致的。这一机制可解释为什么丝素含量越高,就会产生更多的纳米颗粒。

Mercedes等[14]通过采用物理吸附和共沉淀 2种方法合成了粒径为155～170 nm的载姜黄素的丝素纳米粒子,其对癌细胞有明显的细胞毒性且不会降低健康细胞的活性,具有良好的生物相容性和可降解性。Radu等[16]采用沉淀法制备了不同丝素浓度的纳米粒子用以表征纳米粒子的载药和释放药物的性能,结果发现纳米粒的药物释放性能与丝素浓度高度相关,但药物释放速度均较快,在1.5 h内基本完全释放。通过共沉淀法制备的丝素纳米粒子在生长阶段将药物包裹在里面,因而纳米粒子呈现不规则的球形。此外,沉淀法受到丝素和药品浓度的限制,随着丝素浓度提高,其产量增大的同时粒子的粒径也增加,导致纳米粒子粒径的不可控性,后续还需采用如离心、过滤等其它步骤控制粒径的大小。

2.2 盐析法

盐析是生产丝素纳米粒子的有效方法,使用盐析法制备的丝素纳米粒子具有更高的尺寸范围(500～2 000 nm)。 这一过程首先以磷酸钾盐(通常为K2HPO4-KH2PO4)为基础制备盐浴。由于丝素蛋白同时存在亲水和疏水链段,疏水部分可与水分子相互作用,使蛋白质与周围的水分子形成氢键。随着盐浓度的增加,盐离子会吸引部分水分子,从而消除蛋白质分子间的水屏障,增强蛋白质与蛋白质之间的相互作用,因此,蛋白质分子通过疏水相互作用而聚集在一起,并从溶液中沉淀出来[30]。

Tian等[17]开发了一种通过在阿霉素(DOX)和磁性纳米粒子存在下盐析丝素的方法来制备载药纳米粒子,通过调节磁性纳米粒子浓度来调节载药纳米粒子的生成和DOX的包封率。Song等[18]用磷酸钠与磁性纳米粒子采用盐析法制备了姜黄素磁性丝素核壳纳米粒子,用磷酸钠制备的纳米粒子其粒径(90～350 nm)明显小于用磷酸二氢钾制备的粒径(500～1 200 nm)。 使用盐析法制备的丝素纳米粒子大都是核壳结构,表面带有负电荷的磁性纳米粒子将带有正电荷的药物吸附在表面作为核被包裹在丝素外壳内,并且随着磁性纳米粒子的增加,载药量也得到提高。然而,采用盐析法所得纳米粒子的二级结构可能会影响药物释放,并且在制备过程中使用了大量的盐,这在正常的透析周期中很难完全去除。

2.3 电喷雾法

电喷雾法是通过电场来启动丝素溶液的雾化,通过对丝素溶液施加高压,丝素溶液呈纳米颗粒状从注射器中喷出。由于没有使用有机溶剂或盐溶液,获得的丝素纳米粒子纯度很高[31]。使用电喷雾法制备丝素纳米粒子合成稳定且具有高封装效率,此外还具备成本低,可重复等优点[32]。制备过程中丝素溶液的浓度和剪切黏度对纳米粒子的几何形状影响很大,较短的溶解时间和高浓度的丝素溶液可获得更规则的颗粒[33]。

为保持药物的抗肿瘤活性,同时避免其细胞毒性和对正常组织的负面影响,Jing等[21]通过电喷雾法成功制备了粒径为 59～75 nm 的负载顺铂(CDDP)的丝素蛋白纳米颗粒,并且制备过程中不添加任何有机溶剂。Niu等[22]使用电喷雾法制备了干态粒径为40～62 nm的丝素纳米粒子,并将CdSe/ZnS 量子点耦合到纳米粒子表面。Cao等[23]利用载体聚合物的特性,将丝素、聚乙烯醇(PVA) 和治疗药物结合在一起,无需乳化过程,药物包封率达到92.3%。使用电喷雾法通过调节电压直接从喷头喷出小于100 nm的纳米粒子,利用配位键或共价键的结合方式,将药物负载在纳米粒子表面,然而电喷雾法制备纳米粒子速度慢,效率低,并且由于操作参数中涉及的应力(如干燥中的热应力、喷嘴中的剪切应力)可能会导致一些大分子降解,从而影响纳米粒子的成形。

2.4 乳液法

乳液法是将丝素水溶液在机械搅拌或超声波处理等作用下分散到油相中以形成稳定的乳液体系,然后通过去除溶剂/非溶剂而形成纳米颗粒;也可采用复乳法在W/O/W(水包油包水)双乳液法中,使用稳定乳液的表面活性剂将初级W/O(水包油)乳液分散在第二水相中形成乳液系统, 并去除有机溶剂, 以将纳米粒子保存在水性缓冲溶液中[34]。纳米粒子双重乳液的合成是一种快速且节约成本的方法。乳化过程通常是不稳定的,并且会发生颗粒结合以最小化系统的自由能[35];因此,需要表面活性剂和稳定剂来稳定乳液颗粒,然而表面活性剂可能会影响药物基质相互作用和药物在生理环境中的释放速率。

Srisuwan等[36]将丝素蛋白溶液加入到石蜡中加热,采用油包水乳液溶剂蒸发法制备了丝素蛋白颗粒,水相和油相分别为丝素水溶液和石蜡,经甲醇处理后,丝素的构象由无规卷曲变为β折叠。采用该方法制备的纳米粒子尺寸较大,但表面光滑、球形圆整,药物通过非共价吸附的形式被负载到纳米粒子表面。然而,该方法通常存在溶剂残留的问题,影响其生物相容性,因此,在制备过程中要尽量避免使用有机溶剂,降低溶剂在纳米粒子中的残留率。

2.5 脱溶剂法

脱溶剂法是向含有药物的丝素溶液中添加有机溶剂(如乙醇和丙酮)来合成纳米颗粒。有机溶剂会改变丝素蛋白的结构并降低其溶解度,从而形成丝素纳米颗粒。当颗粒尺寸增大到一定程度时会通过相同尺寸颗粒的数量逐渐增加来形成所需要的纳米粒子[30]。通过脱溶剂法制造的丝素纳米粒子可根据条件调整粒径[37]。丝素浓度、溶剂添加速度、pH值和温度是影响粒径的主要因素。在高pH值和低蛋白质浓度的环境下可产生更小的纳米颗粒。

Wu等[24]将紫杉醇(PTX)/乙醇溶液滴加到丝素水溶液中,不添加任何有毒的有机溶剂且避免使用表面活性剂,制备出负载PTX的丝素纳米粒子,平均粒径为130 nm,它们被胃癌细胞摄取,显示出比全身注射游离PTX更高的抗肿瘤效果。Seib等[25]通过使用丙酮制备了负载阿霉素(DOX)的丝素纳米粒子用于乳腺癌的治疗,它们可对不同pH值做出响应,在酸性条件下治疗效果突出。采用脱溶剂法在制备之前将药物与丝素蛋白结合,通过添加乙醇或者丙酮使其自组装,可将药物包覆在丝素纳米粒子中,生成大小均匀的纳米粒子。然而使用该方法制备的纳米粒子产量较低,且过量的丙酮添加会导致丝素大量凝胶化,影响纳米粒子的制备效率。

3 药物的装载与可控释放

3.1 药物的装载

通常,药物以2种方式装载到纳米颗粒上:一是在制备纳米颗粒时使载体材料与药物结合,并同时装载它们;二是将纳米颗粒浸泡在浓缩的药物溶液中完成药物负载。后一种方式适用于在操作过程中易失活变性的药物,但是载药率与缓释效果不理想。纳米颗粒的载药率与缓释效果还受药物溶解度、纳米颗粒大小、介质材料和聚合物等因素影响。聚合物的溶解性与聚合物的组成、分子质量和药物与聚合物的相互作用有关,装载的药物通常具有消炎、抗菌、抗肿瘤等功能。常见的纳米颗粒装载药物有阿霉素、紫杉醇和姜黄素等。Sun等[38]在丝素蛋白颗粒的制备过程中将阿霉素包裹在里面(见图2),制备出了负载阿霉素的丝素蛋白颗粒,颗粒表面粗糙且有明显的空隙,由于阿霉素被包裹在里面导致颗粒形状不规则。颗粒表面还有细小的颗粒,这是由于叶酸被共价接枝到丝素颗粒表面作为肿瘤细胞叶酸受体的靶基团。合成的丝素颗粒具有良好的生物相容性,丝素颗粒与叶酸受体的特异性结合使这些颗粒与肿瘤细胞具有靶向功能。Chen等[39]将紫杉醇溶解到乙醇溶液中然后混合到制备好的丝素纳米粒子中,制备了载药量为6.9%的纳米粒子,整个制备过程简单温和,在临床化疗中具有巨大的应用潜力。Mercedes等[14]使用物理吸附和共沉淀2种方法合成了载姜黄素的丝素纳米颗粒,2种方法制备的姜黄素丝素纳米颗粒对癌细胞具有细胞毒性,同时不会降低健康细胞的活力。

图2 负载阿霉素的丝素蛋白颗粒Fig.2 Doxorubicin loaded silk fibroin particles

3.2 药物的控释

药物的释放与药物分子质量大小、药物可溶性程度、载体材料的生物可降解性有关。此外,给药方法也会影响释放模式。如果药物扩散速率快于基质的分解速率,则释药的主要机制为药物扩散,否则依赖于封装基质的降解[40]。丝素蛋白纳米粒子的药物释放主要为蛋白质侵蚀或降解、药物通过孔扩散、从表面释放或通过带电磁场传输。通过包覆形式负载在纳米颗粒(如沉淀法、盐析法和脱溶剂法制备的纳米颗粒)中的药物主要依靠丝素蛋白的降解从孔隙中释放。而通过吸附或化学键结合的方法负载的纳米颗粒(如电喷雾法和乳液法)释放主要依靠表面药物的扩散。药物的可控释放包含2个方面:一是药物的释放曲线与速度可以进行调控;二是药物的释放位置可进行调控,实现靶向释放。前者可通过人为干预控制丝素中2种结晶结构的含量,从而改变丝素的降解速度,实现药物的可控释放;后者通过丝素蛋白与其它不同降解速度的高聚物按特定比例复合制备纳米粒以实现释放曲线与速度的可调控。靶向释药则适用于一些毒副作用较大易引起全身免疫受损的化疗类药物。一方面靶向释药可明显降低体内副作用,降低对正常细胞的损伤;另一方面在病灶局部释放,形成局部高浓度,可提高药物利用率,获得更优的疗效。目前对药物的靶向控释主要为pH值响应和磁响应,药物在体内通过磁场或者pH值的变化可到达特定部位进行靶向释放,从而实现纳米粒子的控释。

3.2.1 pH值响应

pH值响应型纳米载体因其具有特殊的酸敏或碱敏释药性能成为当前一种重要的纳米载体,特别是酸敏性纳米载体,可用于肿瘤弱酸环境的药物控释。由于正常血液的pH值为7.4左右,肿瘤组织的pH值比正常组织和血液的更低,其pH值在6.6左右,因此酸敏性纳米载体为药物的定点释放和靶向治疗提供了一个积极的方法[41]。此外, 对于肿瘤的治疗, 一般是希望纳米载体在生理pH值下保持药物零泄漏, 在肿瘤位置进行酸敏性释药。而对于口服给药, 则希望纳米载体能在肠道的碱性环境中智能释药。为达到这些目的, 需对纳米载体进行分子设计, 以便获得不同释放机制的pH值响应型纳米药物载体。一般来说,pH值响应型纳米载体的释药主要是由共价键引发的。通过将纳米材料载体表面功能化,使其与药物分子以共价键方式结合,通过这种结合方式可增加纳米药物载体的稳定性,有效防止药物在体内的提前释放[42]。Sun等[38]将叶酸共价接枝到丝素纳米粒子表面作为肿瘤细胞叶酸受体的靶基,通过调节磷酸盐缓冲溶液(PBS)的pH值来模拟人体内肿瘤的环境,当PBS的pH值为7.4时,药物释放速率最慢,释放7 h后达到平衡状态,累积释放率为25.85%。当PBS的pH值为5时, 药物释放速度最快,释放14 h后达到平衡,药物总释放量为68.21%。实验表明,丝素纳米粒子与叶酸受体的特异性结合在酸性条件下有利于药物的释放,这为丝素载药纳米粒子提供了靶向肿瘤细胞的功能,通过调节不同pH值可实现载体药物的控制释放,从而降低药物对正常细胞的伤害。

3.2.2 磁响应

磁性纳米粒子的体积在小于其临界体积时产生的热运动能够抵抗外界施加磁场的干扰,从而显现出一种超顺磁的特性且能够悬浮在液体中。在外界施加磁场的作用下,磁性纳米粒子会被磁化并随磁场发生定向移动,当外界施加的磁场消失,磁性纳米粒子又重新分散在液体中。磁性纳米粒子因其特异的磁响应性能够实现药物的定点递送,提高药物在病灶处的浓度,降低对正常细胞的损伤,提高治疗效果。通过将Fe3O4纳米粒子复合在丝素纳米粒子上,制备具有磁性的丝素载药纳米粒子使其具备超顺磁性及高饱和磁化强度[43]。载药纳米粒子通过动脉注射给药,在外界磁场作用下定位至病灶部位,通过磁性载药纳米粒子聚集所产生的栓塞作用和药物的缓慢释放来达到治疗目的。Tian等[17]制备了负载阿霉素的磁性丝素纳米粒子,通过对大鼠肿瘤处施加磁场可以观察到,纳米粒子在附加磁场的肿瘤处聚集,而肝脏部位只有少量的药物,因此,磁靶向可抑制肝脏对药物的吸收,使其只大量存在于肿瘤部位。Song等[18]制备了一种姜黄素磁性丝素核壳纳米系统用于姜黄素在乳腺癌细胞中的缓释,粒子内部的磁芯提供了使用外部磁铁进行癌症靶向的可能性。

虽然pH值响应和磁响应都能对病灶进行靶向定位,然而仅靠一种内部刺激的药物控释系统无法达到理想的治疗效果。pH值响应型纳米粒子由于在输送到病灶的过程中发生缓释,会对正常细胞造成一定损伤,而磁响应型纳米粒子在病灶处的释放速度无法控制,这2种方法都存在一定的局限性。通过将2种方法结合(见图3),利用载药纳米粒子的磁响应性将药物定位到病灶处,再通过pH值的改变提高其控释性能,从而提高药物的治疗效果,减少药物的副作用,实现智能给药[44]。

图3 智能响应型纳米粒子治疗肿瘤细胞的机制Fig.3 Mechanism of intelligent responsive nanoparticles in treatment of tumor cells

4 结束语

随着纳米技术的发展,载药纳米颗粒在各种疾病的治疗上扮演着重要的角色。与其它蛋白质纳米载体相比,丝素蛋白提取简单且成本低,具有制备条件温和、有机溶剂使用较少、良好的生物相容性的优点,其制备出的纳米粒子力学强度和稳定性较好,使其在遗传物质、抗癌药物、肽类激素、生长因子、脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)等材料的递送中具有明显的优势,且对低分子药物表现出较高的负载效率。丝素蛋白的两亲特性使其可通过自组装的方式形成纳米粒子,避免了交联剂的使用,有望在体内获得更高的利用率。同时在丝素纳米粒子在制备过程中要避免丝素暴露在热、盐、pH值变化和高剪切力的环境下,防止丝素产生自组装形成纤维或凝胶,从而降低生产效率。

蛋白纳米粒未来研究中应关注的重点是如何实现更高的载药效率和药物释放曲线与速度的可控。通过控制纳米粒尺寸、形状和表面电荷、与药物的化学键结合等来提高药物利用效率。通过改变丝素Silk Ⅰ和Silk Ⅱ 2种结晶结构的含量来改变丝素的降解速度,从而实现药物的可控释放;或者通过丝素蛋白与其它不同降解速度的高聚物复合制备纳米粒来实现药物的可控缓释。此外靶向释药也将成为未来研究的热点,对药物的靶向控释主要为pH值响应和磁响应,药物在体内通过磁场或者pH值的变化可到达特定部位进行靶向释放,从而实现纳米粒子的控释,实现智能的纳米粒子给药系统,减少病人的痛苦,降低药物的副作用。也可通过多种响应相结合的方式来进一步提高药物利用率,实现精准医疗。纳米粒在医学方面的应用会更加广泛,对不同部位的疾病治疗效果也会不断提高。