叶用文冠果总多酚提取工艺及抗氧化活性分析

苏泾涵,王改萍*,刘玉华,戚 亚,彭大庆,李守科,曹福亮

(1.南京林业大学,南方现代林业协同创新中心,江苏 南京 210037;2.江苏农林职业技术学院,江苏 句容 212400;3.江苏盐城林场,江苏 盐城 224057;4.山东沃奇农业开发有限公司,山东 潍坊 262106)

文冠果(Xanthocerassorbifolia)为无患子科文冠果属落叶小乔木或灌木,是我国特有的油料树种[1]。文冠果的根、茎、叶、花、果实均可入药,能祛风湿,消肿止痛。文冠果叶富含生物活性物质,加工后可作为茶饮,具有降血脂、降胆固醇等功效[2]。目前,对文冠果的研究主要集中在文冠果果实及油料提取等方面[3-5],文冠果叶总多酚提取工艺的研究鲜见报道。

多酚是一类存在于植物体内具有特殊化学活性的次生代谢产物,具有很好的抗炎抑菌、抗氧化效果,常作为一种天然的抗氧化剂[6]。多酚常见的提取工艺有溶剂萃取法、超声波法、微波法。超声波法操作方便,相比传统的溶剂萃取法缩短了提取时间,且提取效果优于微波法,常应用于中药及天然产物提取方面,具有提取效率高、活性保持良好等优点[7-9]。

超声辅助提取技术就是利用超声波的机械作用、空化作用、热效应等迅速破坏植物细胞,缩短原料中有效成分进入溶剂的时间[10],加快提取过程,提高提取效率,且不易破坏植物体中有效成分,避免其抗氧化等生物活性显著下降[11-12]。目前,李国倩等[13]利用超声波辅助法对文冠果果壳总多酚的含量及抗氧化活性进行了研究,但是对文冠果叶总多酚的提取研究鲜见报道。

本试验用响应面法优化超声波辅助提取文冠果叶总多酚,研究文冠果叶总多酚的最优提取工艺。对15个不同来源地的文冠果叶总多酚含量及其抗氧化活性进行测定,探讨不同来源地的文冠果叶总多酚及其抗氧化活性的差异,旨在为我国特有油料树种文冠果的开发利用提供理论依据,为后续叶用文冠果品种筛选工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验地位于山东省安丘市文冠果种质资源圃,材料于2021年7月进行采集,包括15个不同来源地的成年文冠果,来源地分别为:甘肃张掖、辽宁建平、新疆昌吉、河南沁阳、陕西榆林、内蒙古赤峰、河北张家口、辽宁朝阳、内蒙古翁牛特旗、内蒙古巴彦淖尔、新疆喀什、宁夏银川、安徽凤台、青海乐都、吉林白城。

每个不同来源的文冠果选择3株,设3个重复,分别于东、西、南、北4个方向采集叶片,之后混匀。叶片置于装有干冰的采样盒带回实验室,将叶片清洗干净,经过60 ℃恒温干燥箱烘干,粉碎后过60目(孔径0.25 mm)筛备用。

1.2 试验方法

1.2.1 样品溶液制备

准确称取0.2 g样品,包于脱脂滤纸中,加入一定浓度的乙醇溶液,在不同的提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度的条件下进行提取,所得滤液即为待测液。

1.2.2 文冠果叶总多酚超声波辅助提取

采用单因素试验方法,以额定功率240 W、体积分数60%的乙醇溶液、料液比1∶20 g/mL、提取温度60 ℃、提取时间30 min为固定水平,探究不同水平的单因素对文冠果叶总多酚提取量的影响,为后续响应面法优化文冠果叶总多酚提取实验确立合适的参数范围。

每个单因素实验设置6个水平,乙醇体积分数[14-15]分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%,提取温度[14,16]为30、40、50、60、70、80 ℃,提取时间[17-18]为20、30、40、50、60、70 min,料液比[17,19]分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL。

1.2.3 Box-Behnken响应面法优化文冠果叶总多酚提取实验

依据单因素试验结果,在额定功率下分别对乙醇体积分数(50%、60%、70%)、料液比(1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)、提取时间(30、40、50 min)、提取温度(50、60、70 ℃)4个因子进行3水平试验设计,采用Design Expert 8.0.6统计分析软件的响应面分析法以总多酚提取量为响应值,进行响应面分析实验(RSM),以获取最佳提取工艺参数。

1.2.4 文冠果叶总多酚含量的测定

参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[20],并采用福林酚法[21]进行文冠果叶总多酚含量的测定。

1.2.5 文冠果叶体外抗氧化活性的测定与综合分析

清除总多酚(DPPH)自由基能力参照陈克克等[22]的方法进行测定;总抗氧化能力(FRAP法)参照廖友媛[23]的方法进行测定;采用综合抗氧化能力指数(APC)[24-25]综合评价不同来源文冠果叶总多酚的抗氧化能力。

1.3 数据处理

采用Excel、SPSS 20.0对试验数据进行分析处理并绘图。

2 结果与分析

2.1 文冠果叶总多酚超声波辅助提取

不同体积分数的乙醇对文冠果叶总多酚提取量有明显影响(表1)。乙醇体积分数由40%上升到70%时,文冠果叶总多酚提取量随着乙醇体积分数的增大而增加;乙醇体积分数由70%上升到90%时,文冠果叶总多酚的提取量开始不断减少。当乙醇体积分数为70%时,文冠果叶总多酚的提取量达到最高,为40.27 mg/g。

表1 不同单因素对文冠果叶总多酚提取量的影响

不同的料液比对文冠果叶总多酚提取量有一定的影响(表1)。料液比由1∶10 g/mL变为1∶15 g/mL时,文冠果叶总多酚提取量增加;料液比由1∶15 g/mL变为1∶25 g/mL时,文冠果叶总多酚的提取量增长缓慢;料液比由1∶25 g/mL变为1∶30 g/mL时,文冠果叶总多酚的提取量明显增加;当料液比由1∶30 g/mL变为1∶35 g/mL时,叶总多酚的提取量下降。总体看,当料液比为1∶30 g/mL时,文冠果叶总多酚的提取量达到最高,为42.86 mg/g。

不同提取时间对文冠果叶总多酚提取量有一定的影响(表1)。提取时间由20 min增加到40 min,随着提取时间的增加,文冠果叶总多酚提取量随之增加;提取时间由40 min增加到50 min时,文冠果叶总多酚提取量开始减少,超过50 min时文冠果叶总多酚提取量又开始上升。

不同提取温度对文冠果叶总多酚提取量有一定的影响(表1)。提取温度由30 ℃增加到60 ℃时,总多酚的提取量显著上升;提取温度由60 ℃增加到70 ℃时,文冠果叶总多酚的提取量趋于平稳;由70 ℃增加到80 ℃时,文冠果叶总多酚提取量反而增加,可能是杂质导致含量增加。因此,当提取温度达到60 ℃时,总多酚的提取量达到最高,为40.24 mg/g。

2.2 文冠果叶总多酚响应面法优化提取

2.2.1 响应面模型建立

在单因素实验的基础上,利用Design Expert 8.0.6统计分析软件的响应面分析法设计4因素3水平的文冠果叶总多酚提取优化实验,得到29组多酌提取量如表2所示。

表2 Box-Behnken响应面法设计及实验结果

对表2数据进行二次多项式回归模型方程拟合,得到以乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取温度(D)为影响因素的文冠果叶总多酚提取含量(c)回归方程为:

c=39.348-1.28A+0.110 0B+1.003 3C+3.202 5D-0.117 5AB-0.502 5AC-1.102 5AD+0.345BC+0.322 5BD-0.142 5CD-1.776 5A2+0.834 8B2-0.497 8C2+0.566D2。

2.2.2 响应面回归方程的方差分析与显著性检验

表3 响应面优化实验设计

2.2.3 响应面分析及总多酚最优工艺的确定

通过响应面及等高线的形状和颜色变化(图1),分析4个主要因素间的交互作用对总多酚提取量的影响后发现,乙醇体积分数-提取温度交互的响应面图形曲面最大,颜色变化也最大,判断乙醇体积分数和提取温度之间的交互作用对文冠果叶总多酚提取量的影响最大。利用Design Expert中Box-Behnken对总多酚提取量进行最优化设计,得到的最佳提取条件为:乙醇体积分数58.245%、料液比1∶29.794 g/mL、超声波作用时间42.882 min、提取温度69.601 ℃。为了便于实验的操作,设定提取工艺参数为:乙醇体积分数60%、料液比1∶30 g/mL、提取时间43 min、提取温度70 ℃。在此条件下,文冠果叶总多酚含量测定为43.66 mg/g,与理论值44.78 mg/g相差较小,因此可以设定此条件为文冠果叶总多酚最佳提取工艺。

图1 乙醇体积分数-提取温度交互作用效果图Fig. 1 The interaction effect diagram of material liquid ratio-extraction time

2.3 不同来源文冠果叶总多酚含量及抗氧化能力比较

不同来源文冠果叶总多酚含量及抗氧化活性比较见图2。由图2a可知,15个不同来源地的文冠果叶总多酚平均含量为36.34 mg/g,其中银川、建平、乐都、喀什来源地的文冠果叶总多酚含量较高;15个来源地中文冠果叶片总多酚含量最高的是银川,含量为42.37 mg/g;朝阳与榆林文冠果叶总多酚含量均为35.92 mg/g,二者之间无差异,但均高于来自昌吉、青海、白城、张掖、凤台、张家口来源地的文冠果叶总多酚含量;张家口来源地的文冠果叶总多酚含量最低,仅为27.91 mg/g。

Gz.甘肃张掖 Zhangye, Gansu;Lj.辽宁建平 Jianping,Liaoning;Xc.新疆昌吉 Changji, Xinjiang;Hq.河南沁阳 Qinyang, Henan;Sy.陕西榆林 Yulin, Shaanxi;Ic.内蒙古赤峰 Chifeng, Inner Mongolia;Hz.河北张家口 Zhangjiakou, Hebei;Lc.辽宁朝阳 Chaoyang, Liaoning;Iw.内蒙古翁牛特旗 Wengniute Banner, Inner Mongolia; Ib.内蒙古巴彦淖尔 Bayan Zhuoer, Inner Mongolia;Xk.新疆喀什 Kashgar, Xinjiang;Ny.宁夏银川 Yinchuan, Ningxia;Af.安徽凤台 Fengtai, Anhui;Ql.青海乐都 Ledu,Qinghai;Jb.吉林白城Baicheng, Jilin。下同。The same below.图2 15个不同来源地的文冠果叶总多酚含量及其抗氧化活性比较Fig. 2 A comparison of total polyphenol content and antioxidant activity of X. sorbifolia leaves from 15 different sources

不同来源文冠果叶总多酚对DPPH自由基的清除率差异较大(图2b),15个来源地的文冠果叶总多酚对DPPH自由基清除率的范围为64.33%～92.65%。其中银川来源地样品的DPPH自由基清除率最高为92.65%,张家口来源地样品的DPPH自由基清除率最低为64.33%,银川、乐都、朝阳来源的文冠果叶总多酚清除DPPH自由基的能力较强。

不同来源地文冠果叶总多酚的总抗氧化能力见图2c。结果表明FRAP不同来源地文冠果叶总多酚对总抗氧化差异较大,15个来源地的文冠果叶总多酚的FRAP总抗氧化能力在0.71～1.53 mol/g。其中来自乐都、银川、巴彦淖尔、朝阳来源地的FRAP总抗氧化能力较强,乐都来源的样品FRAP总抗氧化能力最强为1.53 mol/g;张掖的样品FRAP总抗氧化能力最弱为0.71 mol/g。

综上所述, 银川、乐都来源地的文冠果叶片总多酚含量较高且抗氧化能力较强。

2.4 文冠果叶片总多酚抗氧化能力综合评价

不同来源文冠果叶总多酚抗氧化能力指数见表4。由表4知,乐都、银川、朝阳来源的文冠果叶总多酚综合抗氧化能力指数(APC)较高,张掖、张家口、昌吉来源的文冠果叶总多酚综合抗氧化能力指数APC较低;乐都的APC指数最高,为99.73%;昌吉的APC指数最低,仅为62.82%。

表4 15个不同来源文冠果叶片总多酚抗氧化能力指数

2.5 文冠果叶总多酚与抗氧化活性的关系

不同来源文冠果叶总多酚抗氧化能力相关性见表5。由表5可知,不同来源的文冠果叶片总多酚含量与DPPH清除能力、总抗氧化能力均呈极显著(P<0.01)正相关。

表5 不同来源文冠果叶总多酚含量与抗氧化活性 的相关性分析

3 讨 论

随着乙醇体积分数的升高,文冠果叶总多酚提取量在不断上升,但当乙醇体积分数大于70%时总酚含量开始下降,造成此现象的原因可能是文冠果叶多酚类物质与其他物质形成稳定化合物,存在一定极性[26],当乙醇体积分数过高时,溶剂的极性减弱,导致溶出的其他物质与多酚类物质竞争[27-29],使得多酚提取率下降。料液比由1∶10 g/mL变为1∶30 g/mL时,随着乙醇提取剂含量的增加,增大了反应面积[30],促进文冠果叶多酚类物质的提取,但当料液比由1∶30 g/mL变为1∶35 g/mL时,文冠果叶总多酚的含量反而减少,可能由于文冠果叶多酚类物质已经溶出[31],过多的乙醇提取剂导致单位体积内多酚含量变小,降低了文冠果叶总多酚的提取量[32]。

提取时间由40 min变为50 min时,文冠果叶总多酚提取量开始减少,当提取时间继续增长,出现文冠果叶总多酚含量再次增长的现象,造成此结果的原因可能是由于过长的超声时间会使机械力和热能破坏总多酚类物质分解生成其他杂质[33-34];因此选择40 min作为单因素试验最适提取时间。前期随着温度升高,促进分子运动,使得提取剂与物料接触增多,多酚溶出增加[35];当提取温度大于70 ℃时,文冠果叶总多酚提取量不断上升,造成此现象的原因可能是提取温度过高时多酚结构被破坏,生成部分杂质[26,36]。

超声波辅助法有利于植物多酚的提取,此方法节约时间、便于操作,因此选择此方法探究文冠果叶总多酚的最佳提取工艺[37]。前期对文冠果叶片单因素实验进行测定,得到最适提取工艺,并探究了不同体积分数的乙醇、料液比、提取时间、提取温度[38-41]对总多酚提取率的影响,最适工艺条件为:乙醇体积分数70%、料液比1∶30 g/mL、提取时间40 min、提取温度60 ℃。后期为了可以更直观地反映各因素间的交互作用,得到更可靠的预测值,通过Box-Behnken响应面法[42]对文冠果叶总多酚提取率进行优化设计,得到最优提取条件为:乙醇体积分数60%、料液比1∶30 g/mL、超声波作用时间43 min、提取温度70 ℃。在此优化条件下,文冠果叶片总多酚提取量为43.66 mg/g。

目前,对文冠果总多酚含量的研究较少,李媛等[43]研究发现文冠果果壳总多酚含量为10.22 mg/g。本研究发现不同来源的文冠果叶片总多酚平均含量为36.34 mg/g,文冠果叶片的多酚含量远高于文冠果果壳总多酚含量。此外,对于总多酚的研究主要集中在中草药、茶叶及水果方面。陈克克等[22]研究表明北苍术的总多酚含量为11.9 mg/g;马飞跃等[44]研究表明桑葚叶总多酚含量为26.35 mg/g;薛雯等[45]发现葡萄叶总多酚含量为36.594 mg/g;李晓英等[46]发现蓝莓嫩叶的总多酚含量为43.77 mg/g,老叶总多酚含量为38.76 mg/g。综上所述文冠果叶片总多酚含量较高,可作为一种新型植物多酚提取树种。

本研究结果显示文冠果叶片总多酚含量与DPPH清除力、总抗氧化能力呈极显著正相关,即表现为,文冠果叶总多酚含量越高,其DPPH清除力、总抗氧化能力也整体呈上升趋势。这一结论与马飞跃等[44]对不同品种桑叶总酚含量及抗氧化活性的研究结果,以及林宝妹等[47]不同品种嘉宝叶总多酚抗氧化活性的研究结果一致。

15个不同来源地的文冠果叶总多酚平均含量为36.34 mg/g, 其中银川的文冠果叶总多酚含量最高,为42.37 mg/g。银川的DPPH自由基清除率最高,为92.65%;乐都的总抗氧化能力最强,为1.53 mol/g。

综上所述,15个来源地的文冠果叶总多酚含量较高,抗氧化能力较强,文冠果可以作为一种新型总多酚提取植物。