哺乳动物体外成熟卵母细胞的线粒体调控机制研究进展

孙立晨，许晓玲，白佳桦，秦玉圣，刘彦，郭凯军

(1. 北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2. 北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097)

卵母细胞体外成熟(invitromaturation，IVM)是指将生发泡(germinal vesicle，GV)期卵母细胞从窦卵泡腔中取出并在适当的培养体系中培养，使其在体外发育成熟到第二次减数分裂中期(MⅡ)并获得体外受精能力的技术。该技术作为人工辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)以及家畜胚胎工程的重要组成部分，在人类不孕不育和畜牧业领域，特别是家畜种质资源保存、良种扩繁等方面具有较大的应用前景。然而，卵母细胞体外成熟过程是非生理性的，由于没有经历体内排卵前的生长发育过程，缺少胞质成熟事件及物质支持卵母细胞完全发育，此条件下产生的胚胎及胎儿发育潜力较低[1]。在卵母细胞成熟发育过程中，线粒体的数量、形态、分布发生显著变化。因此，线粒体指标常常被认为是衡量卵母细胞胞质成熟的标志之一。为此，本文介绍了卵母细胞成熟机制、体内外成熟差异、线粒体在卵母细胞成熟过程中的调控作用，以及外源线粒体调节剂在卵母细胞体外成熟体系中的应用情况和效果，以期为进一步完善卵母细胞IVM技术体系，提高体外胚胎生产效率提供帮助。

1 卵母细胞减数分裂成熟机制

哺乳动物卵母细胞的成熟进程需经历两次减数分裂过程的精细调节[2]。胚胎期的卵原细胞经历增殖期、生长期、成熟期后停滞在第1次减数分裂前期的双线期[3]。停滞主要是由于卵泡液内存在减数分裂抑制物质，目的是为了完成细胞质成熟、RNA转录、蛋白质合成及细胞质微管重组等过程[4]。排卵前促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)高峰触发减数分裂的恢复，进而引起生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)，卵母细胞纺锤体结构变化，染色体聚集重排，排出第一极体，并停滞在第二次减数分裂中期，此时卵母细胞的核和质均已成熟，卵母细胞做好受精准备[5]。

卵母细胞成熟进程主要是由卵内环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平来有效调控的[6]。腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)通过催化卵丘颗粒细胞产生的ATP维持cAMP水平，并经过缝隙连接通道(gap junction channel，GJC)传递到卵母细胞内维持减数分裂静止[7]。也有研究表明，G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)在卵母细胞内激活AC，直接通过自身级联反应催化ATP磷酸化产生cAMP[8]。此外，壁层颗粒细胞和卵丘颗粒细胞产生的C型钠肽(C-type natriuretic peptide，CNP)特异性结合鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase，GC)偶联受体-利钠肽受体2(natriure-tic peptide receptor 2，NPR2)，激活GC促进高水平环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)合成，继而抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)的水解活性，维持胞内cAMP水平[9-10]。高浓度cAMP激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)引起细胞周期蛋白依赖性激酶磷酸化，导致细胞周期蛋白B(cyclin B)无法合成，无法与游离的催化亚基P34cdc2结合后形成有活性的成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)，从而引起卵母细胞在第一次减数分裂前期的双线期阻滞。这种依赖于高浓度cAMP的PKA通路通过调控MPF活性，维持卵母细胞核处于静止状态，使得细胞核与细胞质尽可能同步成熟，从而达到调控卵母细胞成熟进程的目的。

2 卵母细胞体内外减数分裂成熟发育差异

细胞核和细胞质的成熟过程是相辅相成的，胞质的成熟发育程度决定后期胚胎的发育能力。体内卵母细胞发育过程中，受到cAMP及一些蛋白质合成、降解、磷酸化和去磷酸化等因素调节，核成熟被抑制，为核质同步成熟提供平衡，从而促使核质成熟同步化。但是在体外成熟过程中，未成熟的GV期卵母细胞一旦脱离体内卵泡液的抑制环境后，就会迅速恢复减数分裂，发生GVBD，排出第一极体。同时，缝隙连接蛋白合成被抑制使GJC受阻，cAMP无法大量进入卵母细胞，导致核成熟过早发生[11-12]。此时细胞质中并未完成细胞器的数量积累和重新分布，处于GV期的状态。GJC阻碍也会使营养物质无法及时供应到细胞质内，未充分准备好母源物质的储备利用等，即细胞质不成熟[13]。通常体外成熟卵母细胞的发育能力低于体内成熟的卵母细胞[14]，正是由于核质成熟不同步造成的[15]。

细胞质成熟涉及胞浆内一系列细胞器及各种蛋白的变化。在诱导损伤的卵母细胞中，线粒体可以通过提供更多能量来恢复卵母细胞正常状态[16]，其数量及动态分布变化与卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育密切相关[17]。随着卵母细胞的成熟进程，线粒体由初始合成区域迁移至皮质区，后期分布于胞质中央区域，同时线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷贝数也增多。在线粒体动态系统中，线粒体融合蛋白这种高度保守的跨膜GTP酶作为线粒体动力学(线粒体融合、分布，信号传导等)的关键影响因素对能量的产生至关重要[18]。而体外成熟的卵母细胞和体内成熟的卵母细胞之间的主要差异是线粒体功能和ATP产生的效率，导致卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complex，COCs)耗氧量和卵母细胞氧化代谢较低，体外受精后囊胚率低[19]。

3 卵母细胞减数分裂成熟中线粒体功能及调节机制

作为主要直接能量来源的线粒体在卵母细胞中数量丰富，其在卵母细胞成熟过程中呈动态分布。GV期线粒体主要分布于生发泡周围，分裂前线粒体聚集在纺锤体周围，分裂时几乎都留在卵母细胞内，极少随极体排出[20]。而MⅡ期卵母细胞中的线粒体周围有高电子密度的基质[21]。两次减数分裂后，线粒体又分散于细胞质中为后续发育提供能量。同时，线粒体在卵母细胞成熟的每个阶段都在进行复制，双链环状的mtDNA在绝大多数哺乳动物卵母细胞成熟时数量能达到105个拷贝数，且此过程选择正确的mtDNA保持了遗传的同质性和线粒体的完整性[22]。有研究表明，mtDNA含量对受精结果至关重要，是评估卵母细胞质量的重要标志[23]。

线粒体功能复杂，通过参与调控氧化还原稳态、钙信号传递、细胞周期、胞质内蛋白质稳态等多种信号通路转导的生物学过程，支持染色体分离、受精及胚胎发育[24]。在整个卵母细胞发育和成熟过程中，能量需求递增，在排卵时达到峰值，线粒体发生活跃的氧化磷酸化，产生ATP，为后续受精及胚胎发育做准备[25]。同时，也会产生一定量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，影响卵母细胞成熟。正常条件下，少量的ROS会被线粒体中的抗氧化酶清除，以维持氧化还原稳态。但当线粒体数量减少机能下降时，氧化产生的ROS无法及时清除，积累过多会损伤卵母细胞的发育。线粒体作为双膜细胞器，这种特殊结构在发挥功能上起到重要作用[26]。外膜可选择性渗透小分子，且存在与编码线粒体蛋白有关的转位酶位点。而具有嵴结构的线粒体内膜几乎不渗透，目的为维持跨膜梯度，嵴外侧有电子传递链的蛋白复合体定位点。线粒体膜内质子通过质子泵泵出造成膜内外电位差，即形成线粒体跨膜电位，线粒体跨膜电位作为产生ATP的基础，可预测卵母细胞早期凋亡程度。线粒体功能、分布及结构在卵母细胞发育过程中的显著变化可以作为衡量卵母细胞胞质成熟的指标，有利于在IVM中挑选出更优质的卵母细胞来激活后期受精及胚胎发育更大潜力。

4 外源线粒体调节剂在卵母细胞体外成熟体系中的应用

体外成熟的卵母细胞虽然发育潜力低于体内来源，但是由于其可为胚胎体外生产以及人工辅助生殖提供更多的丰富卵源，因此需要不断完善体外培养体系，从而提高该技术的有效性。线粒体结构和功能与卵母细胞成熟质量密切相关，是影响受精及胚胎发育的重要因素。所以，通过添加外源线粒体调节剂来优化体外培养体系具有重要意义。

4.1 肉碱

肉碱，是一种类氨基酸，属于季铵阳离子复合物，主要作为载体将脂肪酸转运进入细胞线粒体，最终进行β-氧化过程释放能量[27]。同时，作为一种线粒体调节剂，在卵母细胞体外培养中添加肉碱可以抵消能量和氧化还原失衡[28]。左旋肉碱(L-carnitine，LC)调节脂质代谢和葡萄糖代谢，提高呼吸链酶活性，防止氧化应激，抑制细胞凋亡[29]。在培养基中添加2.5 mmol/L的LC可以增加体外成熟水牛卵母细胞的直径和线粒体活性，增强细胞骨架和细胞质重组，增加卵母细胞来源的生长因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)和骨形态发生蛋白15(bonemorpho-geneticprotein 15，BMP15)的分泌，进而促进卵母细胞-颗粒细胞复合体(oocyte-granulosa cell complexes，OGCs)中窦样结构形成，抑制卵母细胞退化，支持水牛卵母细胞体外生长[30]。同样在犬卵母细胞IVM期间补充0.6 mg/mL LC可以改善核成熟、受精率以及体外受精和着床前胚胎发育[31]。LC在辅助生殖技术中可以保护细胞免受氧化损伤引起的细胞凋亡，提高线粒体活性和减数分裂能力，具有改善卵母细胞质量和卵巢功能障碍的潜力[32]。

4.2 辅酶Q10

辅酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)是细胞线粒体电子传递链中的脂溶性电子载体，参与ATP的合成。研究表明CoQ10供应不足会使线粒体功能受损，导致卵母细胞质量降低[33]。在牛卵母细胞体外培养时，添加40 μmol/L CoQ10能显著提高线粒体质量，维持高ATP水平，减少卵母细胞凋亡，使卵母细胞更接近体内正常的发育轨迹[34]。在绵羊卵母细胞体外培养时，添加30 μmol/L CoQ10可促进线粒体的正常分布，平衡能量代谢，降低ROS产生和卵母细胞染色体错位，提高绵羊体外胚胎的产量[35]。CoQ10还可以抑制沉默信息调节因子2相关酶类4(silent mating type information regulation 2 homolog-4，SIRT4)的过表达来减轻衰老引起的线粒体功能障碍，清除ROS积累[36]。在猪卵母细胞培养体系中，添加100 μmol/L CoQ10的还原形式泛醇-10，可以达到促进线粒体更新的效果，从而延缓卵母细胞的衰老[37]。

4.3 C型利尿钠肽

C型利尿钠肽(CNP)作为减数分裂抑制剂，不仅可以优化卵母细胞核和质成熟的同步化程度，也对线粒体分布及功能产生影响。在牛卵母细胞IVM中，添加100 nmol/L CNP可显著优化线粒体分布模式，提高线粒体含量、膜电位，降低ROS含量[38]。另外，在牛卵母细胞体外培养中，添加200 nmol/L CNP预处理6 h后再进行28 h IVM处理，卵母细胞ROS水平显著降低，mtDNA拷贝数和线粒体膜电位显著增加，从而促进牛卵母细胞胞质成熟[39]。此外，添加浓度为200 nmol/L CNP处理体外成熟的绵羊COCs后，线粒体更多地聚集在核和胞浆周围，形成明显团块，可以为卵母细胞成熟过程提供大量能量[40]。CNP可能通过诱导与线粒体发育和抗氧化相关的mRNA转录物和增加蛋白质的相对丰度来提高卵母细胞质量。

4.4 酚类化合物

酚类化合物在自然界中数量众多，从植物提取出的天然酚类化合物具有显著的抗氧化作用，结构内的羟基能够直接清除ROS，或者通过抑制促氧化基因表达，改善细胞氧化应激损伤[41-43]。白藜芦醇是从葡萄、花生、虎杖、桑椹等植物中提取的一种天然抗氧化剂，通过增加线粒体数量及增强线粒体功能，促进颗粒细胞与卵母细胞之间的能量代谢改善卵母细胞发育环境[44]。在IVM培养基中添加0.5 μmol/L的白藜芦醇能够提高细胞内谷胱甘肽水平，促进绵羊卵母细胞的胞质成熟，从而支持后期胚胎高质量发育[45]。川陈皮素是一种具有广泛生物学活性的多甲氧基黄酮类物质，在牛卵母细胞培养中添加25 μmol/L和50 μmol/L可以使线粒体表现出更高的活性，抵消IVM期间ROS过量产生的影响，改善卵母细胞核和质的成熟，以及随后的牛胚胎发育质量[46]。原花青素存在于许多植物的果实、叶子和种子中，研究表明添加100 μmol/L的原花青素B1(procyanidin B1，PB1)处理猪卵母细胞，能够降低活性氧生成以及细胞凋亡水平，增加线粒体膜电位水平和谷胱甘肽(glutataione，GSH)水平[47]。

4.5 褪黑素

褪黑素(melatonin，MT)属于吲哚杂环类化合物，是由哺乳动物脑松果体分泌的胺类激素之一，是一种抗氧化剂。10-9mol/L MT处理的猪COCs中脂肪酸β-氧化和线粒体生物发生相关的基因表达显著上调，脂肪酸、线粒体和ATP含量增加，为卵母细胞成熟和胚胎发育提供能量来源[48]。另有研究表明，高浓度MT(高于500 nmol/L)通过促进线粒体生物发生，消除毒素诱导的线粒体功能障碍，优化猪早期胚胎发育过程[49]。还有研究表明，添加MT后显示卵母细胞线粒体膜电位显著升高，细胞内ROS和Ca2+水平显著降低，这也显示了MT通过保护线粒体功能，促进未成熟卵母细胞健康发育[50]。

5 小结

综上所述，常规获得的未成熟卵母细胞经体外培养发育成熟，具备受精和后期胚胎发育能力，但是易造成胚胎质量及发育潜能降低。通过外源添加线粒体调节剂，优化卵母细胞IVM培养体系，能够促进未成熟卵母细胞的核质同步化成熟，从而建立高效的胚胎体外生产体系，为人工辅助生殖以及良种快速快繁奠定技术支持。