HYOU1对高糖环境施万细胞自噬和凋亡的影响及其机制

周晨明，薛岩，孟丽，朱艳，徐彦楠

1 河北医科大学大型科研仪器设备共享服务平台，石家庄050017；2 河北医科大学第二医院神经内科；3 河北医科大学教学实验中心

糖尿病是由于胰岛素分泌和（或）胰岛素作用缺陷引起的代谢紊乱，患者以高血糖、高血脂和负氮平衡为主要表现［1］。糖尿病周围神经病是糖尿病常见的并发症，其发病与节段性脱髓鞘、轴索损伤有关，是引起患者下肢截肢、残疾和神经性疼痛的重要原因［2］。施万细胞是周围神经系统较为丰富的神经胶质细胞，构成血液—神经界面，不仅是轴突的被动绝缘体，还可动态调节神经纤维的生物学特性，为轴突提供代谢支持，调节外周神经功能［3-4］。施万细胞功能障碍在糖尿病周围神经病变的发生发展中发挥重要作用［5］。自噬通过回收受损的细胞器和错误折叠的蛋白，能够维持细胞稳态和细胞正常的生长与功能［6］。凋亡信号通过多种途径驱动细胞死亡，如线粒体控制信号途径、死亡受体连接信号或内质网应激介导的信号通路如JAK-STAT通路、ROS/PI3K/AKT通路等［7］。在高糖诱导的施万细胞中，抗凋亡因子Bcl-2下调，促凋亡因子Bax上调，细胞色素C释放［8］，凋亡和自噬增强［9］。细胞代谢异常导致活性氧（ROS）累积，易引起凋亡相关基因表达，激活细胞凋亡程序。PI3K/AKT信号通路参与细胞存活、周期、凋亡和物质代谢等生物学过程，与多种肿瘤细胞的凋亡密切相关［10］。本课题组对高糖刺激的大鼠施万细胞RSC96进行转录测序，发现高糖能下调内质网分子伴侣复合物缺氧上调基因1（HYOU1）的表达。HYOU1属于HSP70家族，应激状态如缺氧可导致HYOU1在内质网内大量聚集，参与蛋白质的折叠和分泌［11］。有研究发现，HYOU1可保护缺氧环境下的神经元细胞，其机制与抑制凋亡有关［12］。2022年5月—2023年6月，本研究观察了HYOU1对高糖环境施万细胞自噬和凋亡的影响，并基于凋亡相关通路探讨相关机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 原代大鼠施万细胞株RSC96购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞复苏后置于DMEM培养基中，放置在37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养；待细胞融合达80%时，加入0.05%胰蛋白酶消化，完成传代培养，取第3代细胞进行实验。兔抗HYOU1抗体购自Abcam公司，小鼠抗GAPDH抗体购自Proteintech公司，RIPA强效裂解液购自上海碧云天公司。BCA蛋白定量试剂盒购自南京凯基公司，逆转录试剂盒购自Thermo公司，SYBR Green PCR试剂盒购自Thermo公司，细胞培养箱购自Thermo公司，超净工作台（型号SW-CJ-1FD）购自于苏州安泰科技有限公司，电泳仪（型号Mini Protean 3 Cell）购自Bio-Rad公司，酶标仪（型号MK3）购自Thermo公司。

1.2 HYOU1重组表达质粒的构建 根据设计的HYOU1扩增引物，以人胎脑cDNA文库中的cDNA为模板，以PCR方法扩增HYOU1全长基因序列。对扩增出的PCR产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳，以Lambda DNA EcoRⅠ/Hind Ⅲ标记为DNA相对分子质量，预期获得大小约为1 785 bp的HYOU1序列全长。将pEG-FP-C1载体和HYOU1 PCR片段分别采用Bg1Ⅱ和EcoRⅠ双酶切后，以凝胶回收纯化产物。将两个片段采用T4 DNA连接酶于16 ℃过夜连接；取5 μL连接产物转化到DH5α大肠杆菌中，于37 ℃下过夜培养。挑取单克隆菌落，接种在含有卡那霉素的LB培养基中。将充足质粒pEGFP-HYOU1到Invitrogen公司完成序列分析。

1.3 细胞分组及质粒转染 取第三代RSC96细胞，制成单细胞原液，采用10.0%胎牛血清的DMEM培养基，以1×104/mL接种于96培养板中。采用随机数字表法将细胞分为高糖组、高糖+对照质粒组和高糖+HYOU1质粒组。三组均采用高糖培养，其中高糖+对照质粒组和高糖+HYOU1质粒组分别转染对照质粒和pEGFP-HYOU1质粒，根据Lipofectamine转染试剂说明进行操作。采用免疫荧光法检测转染细胞中HYOU1蛋白，高糖组、高糖+对照质粒组只见蓝色荧光的胞核、胞质未见红色荧光，高糖+HYOU1质粒组胞质中可见红色荧光，说明高糖+HYOU1质粒组细胞中有HYOU1蛋白表达。见OSID码图1。各组细胞培养72 h进行后续操作。

1.4 自噬相关蛋白检测 采用Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3、ATG5、ATG12、Beclin1、p62［11］。预冷PBS并洗涤组织1次，加入200 μL的RIPA裂解液，剥离匀浆器匀浆；于冰上裂解蛋白10 min，4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，将离心后的上清分装到0.5 mL的离心管中。根据BCA蛋白定量试剂盒说明书完成蛋白浓度的测定。经电泳、转膜及封闭后，采用TBST将一抗按比例稀释，将膜与一抗孵育，于4 ℃下过夜；采用TBST稀释HRP标记的二抗，将稀释的二抗与膜孵育45 ～ 60 min；将膜置于凝胶成像系统中进行发光等操作，采用凝胶图像分析软件测定各蛋白条带的灰度值。以β-actin为内参。以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值表示目的蛋白相对表达量。

1.5 细胞凋亡指标检测 各组培养48 h后加入胰蛋白酶完成细胞消化，2 000 r/min离心5 min，预冷PBS清洗2次，重悬细胞；避光加入Annexin V-FITC 5 μL，轻轻混合均匀后，孵育15 min，加入PI 5 μL，轻轻混合均匀后，孵育5 min，1 h内上流式细胞仪检测凋亡细胞，计算总凋亡率。总凋亡率=早期细胞凋亡率+中晚期细胞凋亡率。采用RT-PCR法检测Bax、Bcl-2 mRNA。

1.6 JAK/STAT通路相关蛋白检测 采用Western blotting法检测JAK/STAT通路相关蛋白JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5、STAT6。

1.7 ROS/PI3K/AKT通路相关蛋白检测 通过Western blotting法检测PI3K、AKT、mTOR、pPI3K、pAKT、pmTOR蛋白。采用DCFH-DA染色检测各组ROS水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS26.0软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中自噬相关蛋白表达比较 高糖+HYOU1质粒组LC3、ATG5、ATG12、Beclin1蛋白表达低于高糖组和高糖+对照质粒组，p62蛋白表达高于高糖组和高糖+对照质粒组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞中自噬相关蛋白表达比较（）

表1 各组细胞中自噬相关蛋白表达比较（）

注：与高糖组相比，*P＜0.05；与高糖+对照质粒组相比，#P＜0.05。

组别高糖+HYOU1质粒组高糖+对照质粒组高糖组p62 2.50 ± 0.59*#2.48 ± 0.57 1.12 ± 0.19 LC3 1.29 ± 0.23*#2.73 ± 0.61 2.75 ± 0.63 ATG5 0.86 ± 0.14*#2.89 ± 0.64 2.90 ± 0.66 ATG12 0.95 ± 0.17*#2.71 ± 0.58 2.73 ± 0.60 Beclin1 0.93 ± 0.16*#2.43 ± 0.54 2.45 ± 0.56

2.2 各组凋亡率、凋亡相关基因、JAK/STAT通路蛋白表达比较 高糖+HYOU1质粒组凋亡率、Bax mRNA表达低于高糖组和高糖+对照质粒组，Bcl-2 mRNA表达高于高糖组和高糖+对照质粒组（P均＜0.05），见表2。高糖+HYOU1质粒组JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5、STAT6蛋白表达高于高糖组和高糖+对照质粒组（P均＜0.05），见表3。

表2 各组细胞凋亡率、凋亡相关基因表达比较（）

表2 各组细胞凋亡率、凋亡相关基因表达比较（）

注：与高糖组相比，*P＜0.05；与高糖+对照质粒组相比，#P＜0.05。

Bcl-2 0.78 ± 0.09*#0.51 ± 0.16 0.48 ± 0.17组别高糖+HYOU1质粒组高糖+对照质粒组高糖组细胞凋亡率（%）4.33 ± 0.45*#23.26 ± 2.72 25.39 ± 3.51 Bax 0.34 ± 0.09*#0.58 ± 0.11 0.60 ± 0.12

表3 各组细胞中JAK/STAT通路蛋白表达比较（）

表3 各组细胞中JAK/STAT通路蛋白表达比较（）

注：与高糖组相比，#P＜0.05；与高糖+对照质粒组相比，*P＜0.05。

组别高糖+HYOU1质粒组高糖+对照质粒组高糖组STAT6 1.85 ± 0.36*#0.74 ± 0.12 0.76 ± 0.14 JAK1 2.15 ± 0.52*#0.81 ± 0.16 0.83 ± 0.18 JAK2 1.97 ± 0.27*#0.98 ± 0.21 1.00 ± 0.23 STAT1 2.06 ± 0.54*#1.25 ± 0.36 1.26 ± 0.38 STAT3 2.21 ± 0.56*#1.68 ± 0.42 1.70 ± 0.44 STAT5 2.11 ± 0.48*#1.18 ± 0.25 1.20 ± 0.26

2.3 各组细胞中ROS/PI3K/AKT通路相关蛋白表达比较 高糖+HYOU1质粒组PI3K、AKT、mTOR、pPI3K、pAKT、pmTOR蛋白表达高于高糖组和高糖+对照质粒组，ROS水平低于高糖组和高糖+对照质粒组（P均＜0.05）。见表4。

表4 各组细胞中ROS/PI3K/AKT通路蛋白表达比较（）

表4 各组细胞中ROS/PI3K/AKT通路蛋白表达比较（）

注：与高糖组相比，*P＜0.05；与高糖+对照质粒组相比，#P＜0.05。

组别高糖+HYOU1质粒组高糖+对照质粒组高糖组pmTOR 1.77 ± 0.43*#1.18 ± 0.36 1.17 ± 0.34 ROS 1.55 ± 0.23*#7.24 ± 0.27 6.32 ± 0.42 PI3K 1.58 ± 0.31*#0.79 ± 0.16 0.81 ± 0.18 AKT 1.94 ± 0.46*#0.84 ± 0.19 0.86 ± 0.21 mTOR 0.95 ± 0.14*#0.89 ± 0.24 0.91 ± 0.26 pPI3K 1.43 ± 0.36*#1.01 ± 0.29 1.03 ± 0.31 pAKT 1.82 ± 0.46*#1.14 ± 0.32 1.13 ± 0.31

3 讨论

研究表明，糖尿病周围神经病的发病与长期高糖状态使外周神经长期受到氧化应激刺激有关［13］。施万细胞作为周围神经胶质细胞，能直接参与人体周围神经的形成及发育过程，在修复受损神经中发挥了重要的作用。有研究表明，长期糖尿病状态可导致施万细胞凋亡［14］。此外，高糖刺激下的施万细胞凋亡随着炎症细胞的浸润而加剧［15］。施万细胞凋亡是糖尿病周围神经病变的重要病理特征。本课题组对高糖刺激的大鼠施万细胞（RSC96）进行转录组测序发现，差异基因的富集分析显示，富集在内质网分子伴侣复合物的差异基因与正常糖组相比均出现下调，其中包括HYOU1。因此推测高糖诱导施万细胞的自噬抑制与调亡可能与HYOU1下调有关。本研究中，高糖+HYOU1质粒组自噬相关蛋白LC3、ATG5、ATG12、Beclin1表达低于高糖组和高糖+对照质粒组，p62表达高于高糖组和高糖+对照质粒组，细胞凋亡率低于高糖组和高糖+对照质粒组，这表明HYOU1施万细胞高表达后，能降低高糖状态下施万细胞的自噬水平并抑制细胞凋亡。分析原因：HYOU1是粗面内质网内进行蛋白质质量控制的重要组成成分，主要由分子伴侣、辅助分子和蛋白修饰酶构成。越来越多的研究表明，内质网分子伴侣复合物异常与糖尿病及其并发症的发生有关。持续的高糖状态能引起HYOU1表达下调，而上调HYOU1表达能为糖尿病周围神经病治疗提供新的思路和方法［16］。

施万细胞的自噬及凋亡的发生常伴有相关信号通路的共同参与，如JAK/STAT通路。细胞内一类分子JAK在接受上游受体分子信号后，能迅速募集于受体上并发生活化，而活化JAK催化受体后能发生酪氨酸磷酸化，并激活STAT3，被激活的两个STAT分子形成二聚体并转移到细胞核，并与细胞核中靶基因启动子中的DNA特异性结合，进而对其下游靶基因进行调控［17］。有研究发现，在1型糖尿病大鼠模型的背根神经节，失调的JAK/STAT通路传导可导致感觉神经元中线粒体功能障碍，引起大鼠坐骨神经的沃勒变性［13］。也有研究表明，睫状神经营养因子可通过JAK/STAT信号传导使受损的线粒体生物能量正常化，增强轴突再生和防止糖尿病纤维变性的能力［16］。Bax和Bcl-2是调控细胞凋亡过程中的重要因子。当细胞受到损伤时，细胞内信号转导途径被激活，能促进凋亡蛋白Bax的活性，使线粒体膜的通透性增加，大量细胞色素C穿过膜组织进入细胞质，激活细胞的凋亡途径，促进细胞凋亡。本研究中，高糖+HYOU1质粒组JAK/STAT通路相关蛋白JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5、STAT6表达高于高糖组和高糖+对照质粒组；高糖+HYOU1质粒组与高糖组和高糖+对照质粒组相比，Bax mRNA表达降低、Bcl-2 mRNA表达升高，进一步验证了HYOU1高表达能够抑制高糖状态下施万细胞的自噬和凋亡。

ROS是机体受到刺激时产生的一组不稳定、含氧的活性分子化合物的统称，具有较高的化学活性，对生物体及细胞的生理活动发挥重要的调节作用。当机体处于生理状态下且无外界刺激时，ROS生成量较少，当细胞代谢异常产生大量活性氧超过抗氧化系统的还原能力时，细胞处于氧化应激状态，易引起凋亡相关基因的表达，继而激活细胞凋亡程序［18］。ROS/PI3K/AKT通路可以调控炎症因子的释放、氧化应激、细胞凋亡和自噬，在糖尿病的发生展过程中起重要作用。有研究表明糖尿病周围神经病中施万细胞的PI3K/AKT通路被明显抑制［19］，在高糖环境下，施万细胞中磷酸化AKT表达显著降低，AKT活化抑制［20］。本研究结果显示，高糖+HYOU1质粒组ROS水平低于高糖组和高糖+对照质粒组，而PI3K、AKT、mTOR、pPI3K、pAKT、pmTOR蛋白表达高于高糖组和高糖+对照质粒组，提示HYOU1过表达后，能激活糖尿病施万细胞中的ROS/PI3K/AKT通路，影响相关蛋白的表达，进而调控细胞的自噬和凋亡。

综上所述，HYOU1过表达可下调高糖环境施万细胞的自噬和凋亡，可能与调控ROS/PI3K/AKT通路有关，以上结果为糖尿病周围神经病的防治提供了一定理论基础。