天冬氨酸酰基转移酶及其相关疾病的研究进展*

张颖贞,王一丹,王培昌 综述,付静轩 审校

首都医科大学宣武医院检验科,北京 100053

N-乙酰-L-天冬氨酸(NAA)是由神经元产生的天冬氨酸衍生物,是大脑中含量第二高的氨基酸/氨基酸衍生物,仅次于含量第一位的谷氨酸。NAA代谢通过影响水的运输、髓鞘合成、神经细胞能量代谢等方面进而影响神经系统功能,NAA增多或减少均会引起神经系统疾病。天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)是将NAA分解为天冬氨酸和乙酸盐的酶,在维持NAA代谢平衡过程中发挥重要作用。ASPA突变可导致罕见病卡纳万病(CD),CD预后极差。此外,近些年关于甲基化ASPA基因在衰老预测模型中的报道逐渐增多,提示了ASPA在神经系统之外的作用。本文将对ASPA的生物学功能、ASPA突变所致CD的临床症状及治疗,以及甲基化ASPA基因在衰老中的作用进行综述。

1 ASPA及其底物NAA的生物学作用

ASPA在大脑少突胶质细胞中广泛表达,其作用是催化脑组织中NAA为天冬氨酸和乙酸盐[1]。ASPA基因位于染色体17p13.2上,由6个外显子和5个内含子组成。ASPA由313个氨基酸构成,其相对分子质量大小为36.7×103,ASPA在肾组织中表达最高,其次是脑组织、脂肪组织、小肠等。在脑组织中,ASPA在白质束和丘脑中表达最多。细胞水平上,ASPA仅在白质和灰质的少突胶质细胞胞质部分表达,而细胞膜部分不表达[2]。ASPA在物种进化过程中是保守的,ASPA及其底物NAA在正常大脑生物学功能中起着重要作用。

NAA是一种由神经细胞产生的天冬氨酸衍生物,是大脑中含量第二高的氨基酸/氨基酸衍生物,仅次于含量第一位的谷氨酸。NAA在脑组织中表达丰富,而在其他组织中含量极少。目前常用的检测方法为磁共振波谱分析(MRS)。在神经细胞线粒体中,天冬氨酸-N-乙酰转移酶(Asp-NAT)由NAT8L基因编码,负责将天冬氨酸和乙酰辅酶A合成为NAA,与负责降解NAA的ASPA不同,Asp-NAT只在神经细胞中表达,而ASPA在多种组织中均有表达。NAA在神经细胞线粒体合成后,通过二羧酸转运酶转运至细胞质,最终转运至少突胶质细胞由ASPA降解。钠依赖性二羧酸共转运蛋白3(NaDC3)参与NAA进入星形胶质细胞和少突胶质细胞的运输[3]。NAA和ATP代谢间接相关,NAA在神经元线粒体能量代谢中起着不可或缺的作用[4]。NAA也是哺乳动物神经系统中第三大神经递质N-乙酰天冬氨酸谷氨酸(NAAG)的前体[5-6]。NAA在出生后发育期间对脂质合成至关重要。NAA代谢产生的乙酸盐用于乙酰辅酶A的合成从而参与髓磷脂的合成。因此,由NAA代谢障碍导致乙酸盐供应不足将导致髓磷脂合成缺陷[7]。NAA可以反映神经细胞功能,被视为神经细胞健康的标志物,有研究报道,正常衰老过程中随着年龄增加NAA的水平随之减少[8]。NAA水平与多种神经疾病密切相关,在阿尔茨海默病、癫痫、精神分裂症、多发性硬化症中NAA水平降低,而在罕见病CD中,NAA水平相对升高,CD患者脑组织中NAA水平比正常水平高30%,尿液、血浆和脑脊液中NAA水平比正常水平高出300倍[9]。

2 ASPA突变所致疾病CD

CD是一种致命的儿童神经系统疾病。由NAA代谢障碍导致的髓鞘合成障碍和白质病变为CD特征性改变。目前,CD是与ASPA基因突变关系最为密切的一种疾病。ASPA基因突变包括错义/无义、剪接、缺失和插入[10]。当ASPA突变后,其酶活性降低或含量减少,不能将具有神经毒性的NAA充分水解,致使NAA在尿液、血浆、脑组织中聚集,使大脑发生海绵状变性、脱髓鞘以及运动功能缺陷,最终导致中枢神经系统功能异常[11-12]。CD是一种常染色体隐性遗传病,伴随神经退行性改变,常见于德系犹太人群,发病率为1/6 400至1/13 500,每40～58例德系犹太人中就有1例是携带者[13]。在非犹太患者中,CD是最常见的遗传性脑白质营养不良[14]。在普通人群中,CD的发病率为1/100 000[15]。而我国关于CD的报道较少。

2.1CD的临床表现 CD普遍在婴儿时期发病,表现为严重的智力障碍和发育迟缓[16]。CD的早期症状包括易怒和头部控制不良的肌张力减退。通常,发育迟缓和大头畸形在6个月后变得明显。尽管有严重的发育迟缓,CD患儿有时可以与他人互动、微笑、伸手拿东西。CD患儿后期发展为视神经萎缩和视网膜退化、轴索张力持续减退、手臂和腿部的张力减退转变为肢体僵硬和痉挛。随着年龄的增长,患儿变得越来越虚弱,经常发生癫痫,无法移动或自主吞咽[17]。典型CD的长期预后仍然很差,通常在青春期之前死亡,而一些病情较轻的患者则能活过20岁。

2.2CD的病理机制 目前,研究人员正在使用小鼠模型研究CD中白质变性或髓鞘损伤的机制,并就CD的病理生理学提出了几个假说。一种假说是NAA分解代谢紊乱导致神经细胞和胶质细胞水肿。NAA可以作为分子水泵,通过被ASPA水解成醋酸盐和天冬氨酸来去除神经元中的代谢水,当不断积累的NAA不能被ASPA水解时,神经细胞、胶质细胞水肿,细胞外液渗透压失衡[18]。另一种假说是合成髓磷脂所必需的醋酸盐是通过ASPA水解NAA提供的。因此,由NAA代谢障碍导致乙酸盐供应不足将导致髓磷脂合成缺陷[7]。还有一种假说是,NAA代谢过程中产生的乙酰辅酶A既可通过影响脂肪酸合成最终影响髓鞘形成,也可通过影响ATP形成参与能量代谢[19-20]。然而,CD的发病机制不仅涉及NAA代谢紊乱,还涉及少突胶质细胞中NAA相关信号传导过程[21-23]。总之,与许多其他神经系统疾病类似,多种机制共同参与CD的病理过程。

2.3CD的诊断 目前,CD的检测方法主要包括尿NAA水平、脑磁共振成像(MRI)和测序等。CD患者尿NAA水平明显高于健康者,通常是健康者的100多倍,而其他白质营养不良病例中,NAA水平只是略有升高(约4～ 6倍)。因此,与其他白质营养不良相比,NAA明显升高对CD诊断更具有特异性,检测尿NAA水平有助于诊断CD[9]。MRI在CD诊断中同样起重要作用。CD的MRI表现为弥漫性白质受累,主要位于皮质下区域、基底神经节和桥脑背侧[24]。CD在MRI也有一些非典型、罕见的特征,如多囊外观,筛状外观[25-26]。NAA峰值升高、NAA/肌酐升高以及NAA/胆碱升高是CD在磁共振波谱(MRS)中的特征表现[24]。此外,全外显子组测序可帮助CD诊断,特别是对缺乏特定表型的患者。有研究对1例疑似CD的先证者进行全外显子组测序,通过先证者及其父母和兄弟的Sanger测序对候选变异进行验证,结果表明ASPA基因的复合杂合变异可能是该患者CD病的基础[27]。

2.4CD的治疗 CD的治疗主要是对症治疗,可以分为基因治疗和药物治疗。

2.4.1CD的基因治疗 鉴于CD是由ASPA缺乏引起的,ASPA基因替代疗法或降低NAT8L基因的表达,恢复功能性ASPA的表达,有望治疗CD。注射含有ASPA基因的重组腺相关病毒颗粒[28-29]、敲除NAT8L[30-32]均可以降低大脑中升高的NAA水平。有研究联合以上两种基因疗法,在CD小鼠中进行了研究,结果表明联合疗法可以使CD小鼠脑质量空泡减少并长期逆转CD小鼠所有病理特征,包括体重减轻、运动障碍、NAA水平升高、星形胶质细胞增生和脱髓鞘[33]。此外,敲除编码NaDC3的SLC13A3基因后,CD小鼠大脑中的NAA水平完全正常化,阻止了小脑和丘脑空泡化,并显著改善了运动性能[3]。

近年来,诱导性多功能干细胞(iPSC)、反义寡核苷酸也被用于CD的治疗。通过慢病毒转染或CRISPR / Cas9介导的基因编辑技术将野生型ASPA基因引入患者iPSC中,然后分离出表达野生型ASPA基因的神经祖细胞,证明所得神经祖细胞具有ASPA酶活性后进行移植。移植的ASPA野生型神经祖细胞能够在CD小鼠大脑中存活,并重建了CD小鼠大脑中ASPA的活性,降低了脑组织和脑脊液中的NAA水平,并使CD小鼠标志性病理表型,如脑海绵变性、髓鞘形成缺陷和运动功能障碍有所改善[34]。iPSC技术为CD治疗提供了新思路。反义寡核苷酸是RNA或DNA的一小段单链分子,与特定的mRNA序列结合,改变mRNA剪接,从而修饰所得到的蛋白质产物或抑制翻译,从而降低蛋白质表达[35]。有研究证明,通过向年轻成年ASPA缺陷小鼠注入反义寡核苷酸来抑制NAA合成,可以逆转其先前存在的共济失调并减少小脑和丘脑空泡和浦肯野细胞树突状萎缩[36]。

最近,利用慢病毒和重组腺相关病毒(AAV)的中枢神经系统定向基因治疗取得了成功,并已尝试进行临床试验[28,37]。目前的研究表明,这种方法需要进一步优化,最近的研究重点是新型AAV载体和靶向治疗少突胶质细胞[29]。这些新方法可能使ASPA基因治疗成为现实。

2.4.2CD的药物治疗 CD的药物治疗主要集中在降低脑NAA水平、降低NAA相关的氧化应激、改善渗透压失调或增加乙酰辅酶A和脂质合成。

(1)降低脑NAA水平。降低ASPA缺乏症中的脑NAA水平,可以通过阻断神经元合成或释放NAA、阻断星形胶质细胞/少突胶质细胞对NAA的摄取等途径。Asp-NAT抑制剂可以通过减少NAA的合成,降低脑NAA水平。Zn2+是Asp-NAT活性的直接浓度依赖性抑制剂,但Zn2+在CD中的治疗作用尚未进行评估[38]。NaDC3抑制剂可以通过阻断星形胶质细胞/少突胶质细胞对NAA的摄取,降低脑NAA水平。二羧酸盐,如琥珀酸盐、α-酮戊二酸和富马酸盐以及柠檬酸三羧酸盐能显著抑制NAA吸收[39]。然而,二羧酸盐不能通过血脑屏障,因此需要鉴定和开发新型可通过血脑屏障的NaDC3抑制剂或者通过鼻内给药绕过血脑屏障来提高生物利用度来进一步验证并提高疗效。活性ASPA的酶替代疗法也可以降低脑NAA水平[40]。(2)降低NAA相关的氧化应激。硫辛酸是一种已知能穿过血脑屏障的抗氧化剂。在NAA给药前,硫辛酸预处理2 d,可以阻断急性NAA给药引起的大鼠氧化应激的所有症状[41]。这些结果提示补充抗氧化剂是一种治疗CD的方法,但抗氧化剂在CD动物模型和患者中的作用仍有待进一步研究。(3)改善渗透压失调。托吡酯是一种抗癫痫药物,能有效治疗成人和儿童广泛的癫痫类型。在两例6个月大的CD患者中使用托吡酯治疗,分别在7个月和15个月的随访中显示头部生长速度下降[42]。然而,其作用机制尚不清楚。(4)增加乙酰辅酶A和脂质合成。增加脑乙酸盐和乙酰辅酶A水平可以为CD治疗提供益处。三乙酸甘油(GTA)是一种短链三酰甘油,可以作为乙酸前体。GTA方案治疗约120 d的CD大鼠大脑和脊髓中的空泡适度减少、髓磷脂增加、运动性能显著改善[43]。但是GTA治疗并没有缓解CD婴儿的症状[44]。甘油三庚酸(GTH)是一种合成的三酰甘油。GTH衍生物转化后可增加脂质合成。新生Nur7小鼠(CD模型小鼠)膳食中补充GTH可增加大脑中的髓磷脂,减少氧化应激,促进少突胶质细胞长期存活,改善小鼠脑海绵状变性和运动功能[45]。然而,GTA和GTH治疗在临床前和临床研究中仅部分有效,对于CD患者,GTA和GTH治疗效果仍有待检验。白藜芦醇通过影响CD患者成纤维细胞中的ASPA和参与髓鞘形成的调节转录程序的POU3因子的表达,可能对CD患者有益[46]。

由于CD的发病过程中存在多种机制,联合使用Asp-NAT抑制剂、聚乙二醇修饰的ASPA和GTH膳食补充剂,可以通过抑制Asp-NAT和增加ASPA活性来降低脑NAA水平,提高大脑乙酸水平,增加乙酰辅酶A的形成从而使CD患者获得更好的治疗效果[15]。

3 小 结

近些年来,利用多种基因甲基化标志物构建年龄预测模型的研究逐渐成为热点,并初步应用于法医领域。诸多研究表明,ASPA基因甲基化程度随年龄下调,ASPA基因不同CpG位点甲基化程度是多种年龄预测模型的预测因子[47-50]。ASPA基因甲基化程度在衰老领域的研究提示了ASPA在神经系统之外的作用,但目前鲜见相关报道。

综上所述,ASPA在神经系统发挥重要作用,通过降解重要氨基酸衍生物NAA维持其代谢平衡,保障神经系统水的运输、髓鞘合成、神经细胞能量代谢等功能的正常运行。当ASPA突变导致其酶活性降低时,会引起罕见疾病CD,CD目前预后及其不良,没有有效治疗方法,研究人员试图通过基因疗法缓解该病,但效果欠佳,且多数研究停留在动物层面。在治愈CD方面还需更加深入的研究。此外,近些年关于ASPA基因甲基化在衰老预测模型中的报道逐渐增多,提示了ASPA在神经系统之外的作用,但具体发挥的作用及其机制尚不清楚,仍需进一步研究。