基于UHPLC-QTOF-MS鉴别刺葡萄酒和赤霞珠葡萄酒研究初探*

黄小贝，易 姿，杨丽霞，曾希珂，袁 圆，邱志鹏

(1 长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410016；2 国家酒类产品质量检验检测中心(湖南)，湖南 长沙 410016)

刺葡萄(Prickly Grapes)原产于中国，属于东亚葡萄属[1]。为我国特有种，主要分布于亚热带季风气候盛行的岭南地区，如长江流域和云贵高原的湖南、云南、广东、江西、浙江等省[2-3]。刺葡萄富含酚类物质，具有独特的香气[4]。刺葡萄果粒小，种籽多，糖度低，果皮厚，不利于鲜食，却是高品质的加工原料[5]。但与葡萄相比，刺葡萄在葡萄酒生产中需要更多的加工程序。刺葡萄酒颜色艳丽为紫红色，风味独特，含有丰富的花青素、维生素、白藜芦醇、儿茶酚、槲皮酮等[6-8]，有助于清除自由基，预防癌症和动脉粥样硬化等疾病[9-10]。进一步发展刺葡萄酒加工产业，有利于使刺葡萄走出鲜食的局限性，同时为中国葡萄酒步入国际市场奠定良好的基础。

近年来，超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用(UHPLC-QTOF-MS)已被用作食品分析的强大分析工具，并与主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘判别分析(partical least square-discriminant analysis，PLS-DA)等多种化学计量统计分析方法相结合，用于食品产地溯源[11-12]、鉴别[13-14]和代谢组学[15-16]等的系统分析。本工作拟采用UHPLC-QTOF-MS分析系统对刺葡萄酒和赤霞珠葡萄酒样品进行组学分析，并尝试用偏最小二乘法建立预测模型对其进行区分。

1 实 验

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品材料

刺葡萄酒样品共计22份，分别由湖南株洲君旗酒业有限公司、湖南龙城葡萄酒酒庄、湖南唯楚果汁酒业有限公司、湖南湘易源酒业有限公司、江西君之谷、誉马庄园葡萄酒业有限公司共计6家酒类厂商生产提供。

赤霞珠葡萄酒样品共计16份，分别由中粮酒业有限公司、香格里拉酒业股份有限公司、中法合营王朝葡萄酿酒有限公司、秦皇岛玛歌葡萄酿酒有限公司、巴罗莎公爵酒庄、香格里拉(秦皇岛)葡萄酒有限公司、王朝葡萄酿酒有限公司、贺兰神(宁夏)国际葡萄酒庄有限公司、威龙葡萄酒股份有限公司、嘉璐国际(烟台)葡萄酒有限公司等16家酒类厂商生产提供。

以上所选样品均用于建模，并且其样品均为单一葡萄品种酿造。另外，选择由刺葡萄和赤霞珠葡萄混合酿造样品10份。

1.1.2 试剂耗材

甲醇(色谱纯)，德国Merck公司；乙酸铵(分析纯)，国药化学试剂集团；甲酸(色谱纯)，阿拉丁(aladdin)公司；聚四氟乙烯滤膜(0.22 μm，PTFE)，上海迪科马分析技术有限公司；G1969-8500液质调谐液，美国安捷伦科技有限公司；HP-0921飞行时间质谱参比液(TFANH4，Purine)，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪(1290 LC &6545 Q-TOF MS)：配有喷射流技术离子源(Dual-AJS)及数据分析工作站Profinder B.08.00软件、Mass Profiler Professiona(MPP)软件和Classifier 1.0，美国安捷伦科技有限公司；ST16R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；SK-1快速混匀器，江苏省金坛市医疗仪器厂；Direct-Q8R超纯水机，美国Millipore公司。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱温：40 ℃；进样量：2 μL。流动相：A相为水(含0.1%甲酸和0.5 mmol/L乙酸铵)，B相为乙腈。流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase gradient elution program

1.3.2 质谱条件

喷射流技术离子源(Dual-AJS)；正离子全扫描模式；毛细管电压3 500 V；干燥器温度320 ℃；干燥器流速8 L/min；雾化器压力241.3 kPa；鞘气温度350 ℃；鞘气流速11 L/min；碎裂电压120 V；m/z扫描范围100～1 000；采集速率2 spectra/s；参比离子m/z121.050873和m/z922.009798。

1.4 样品的制备

准确量取1 mL红葡萄酒样品经0.22 μm聚四氟乙烯滤膜过滤后置于进样瓶中，待检测。

质控样品的制备：从每个样品待测液中取等体积的液体进行混合，制备成质控样品(quality control，QC)用于检测仪器的灵敏度和稳定性，并用于后续分析的数据矫正。

1.5 数据处理与统计分析

MassHunter工作站上采集的质谱数据用Profinder B.08.00软件进行处理，找出所有样品中的化合物，再运用MPP进行统计学分析，并通过偏最小二乘法(Partial Least Squares Discrimination，PLSD)建立预测模型。MPP为原始数据的质谱比对、峰值检测和统计学分析提供了自动化工作流程。

2 结果与分析

2.1 色谱-质谱条件的选择

2.1.1 色谱条件的优化

在正离子模式下，考察了4种流动相体系：0.1%(V/V)甲酸水(含0.5 mmol/L乙酸铵)-乙腈流动相体系、水-乙腈流动相体系、0.1%(V/V)甲酸水-乙腈流动相体系、0.5 mmol/L乙酸铵-乙腈流动相体系。结果表明(如图1所示)，采用0.1%(V/V)甲酸水(含0.5 mmol/L乙酸铵)-乙腈流动相体系时，获得的色谱图峰型更清晰，提高了色谱分辨率，化合物响应高，利用Profinder B.08.00软件可以分析到更多化合物，可达9 000多种。因此，为了检测到更多化合物，以发现不同组别样品间的差异性，提高预测模型的准确性，选用0.1%(V/V)甲酸水(含0.5 mmol/L乙酸铵)-乙腈体系作流动相。

2.1.2 质谱条件的优化

(1)正负离子的选择。本实验分别考察了葡萄酒样品在正负两种质谱电离模式条件下的响应情况。样品分别采用喷射流技术离子源(Dual-AJS)的正离子全扫描模式和负离子全扫描模式进行扫描，再利用Profinder B.08.00软件找出化合物。结果表明，正离子全扫模式下，化合物响应峰高、识别数量、分子分离等方面要明显优于负离子模式，故本实验采用正离子全扫模式。

(2)质荷比扫描范围的确定。在正离子全扫描模式下，分别设置m/z的扫描范围100～3 200、50～1 700和100～1 000三种，经Profinder B.08.00软件分析得到化合物数量分别为：8 557、9 723、7 215。虽然m/z扫描50～1 700得到化合物最多，但是以小分子为主，大部分化合物是溶剂中无差异性物质，不利于后期的软件分析与数据建模，故本实验m/z的扫描范围选择100～1 000。

2.2 总离子流图

在优化的色谱-质谱条件下，对质控样品(按1.1.1制备)和空白样品(甲醇)进行检测，测得的总离子流图(TIC)如图2所示。

图2 质控样品和空白样品(甲醇)的总离子流图(TIC)Fig.2 Total ion flow chart (TIC)of quality control sample and blank sample (methanol)

2.3 化合物提取参数的设置

图3 特征化合物在各组别分布图Fig.3 Distribution of characterized compounds in each group

2.4 特征化合物的筛选

利用MPP数据分析软件，对2.3中提取到的6 838个化合物以倍性变化(fold change，FC)的2为差异阈值，P≤0.01，出现频率(frequency)为100%进行过滤筛选，得到1 492个特征化合物，见图4(火山图)。

进一步设置筛选条件：变异系数(coefficient of variation，CV)≥250%，丰度(abundance)大于等于最大丰度化合物的20%进行过滤筛选，共得到174个化合物，其分布图见图5。

图4 火山图Fig.4 Volcano plot

图5 经筛选后的特征化合物在各组别分布图Fig.5 Distribution of filtered characterized compounds in each group

2.5 主成分分析(PCA)

将筛选后的样品数据导入MPP软件，以筛选后的174个化合物为基础，进行PCA分析，结果见图6。品种鉴别中得到4个主成分，PC1、PC2、PC3和PC4的贡献率分别为62.07%，5.33%，4.86%和3.84%，累计贡献率为76.1%，综合贡献率较高。因此PCA模型能够可以区分葡萄酒和刺葡萄酒。

图6 主成分分析图Fig.6 The three-dimensional figure for principal component analysis

2.6 建立预测模型

以偏最小二乘法(Partial Least Squares Discrimination，PLSD)建立预测模型。从图7中得到，当VIP≥1时，化合物为115个。R2和Q2为数据模型质量参数，数值越接近1说明模型的拟合效果和预测能力越好[17]。该模型中R2X(cum)=0.846，R2Y(cum)=0.995，Q2(cum)=0.994，说明模型预测能力强，准确率高。

图7 偏最小二乘法预测模型评价图Fig.7 Evaluation chart of partial least squaresdiscrimination

2.7 韦恩图(Venn)

对2.4部分6 838个化合物以Re-run条件为在任一组别中100%出现为筛选条件，共得到4 843个特征化合物，其中刺葡萄酒特有化合物1 543个，赤霞珠葡萄酒特有化合物812个，两组共有化合物2 488个，见图8。说明，刺葡萄酒和葡萄酒具有一定区分特点，能较好的进行组别判定。

图8 韦恩图Fig.8 Venndiagram

2.8 真伪鉴别的盲样测试

利用建立的PLSD预测模型对10种葡萄酒进行品种鉴别。其中1～5号酒样为刺葡萄酒，6～10号为赤霞珠葡萄酒，进样检测后，用预测模型进行判定，其检测结果正确率为90%，见表2。证明此模型准确性高，具有一定的运用价值。

表2 葡萄酒样品测试结果Table 2 Wine sample test results

续表2

3 结 论

本研究使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱在全扫模式下，对两个品种葡萄原料的葡萄酒进行了指纹图谱分析，获取了多种化合物谱图，通过多区间分子量、多选择分子筛选条件等挑选特征化合物，利用统计学软件进行非靶向性分析，建立了鉴定预测模型，进行了刺葡萄酒和赤霞珠葡萄酒鉴别的研究初探。此模型对于刺葡萄酒和赤霞珠葡萄酒鉴别有指导意义，同时为以后鉴别两个或多个品种及产地的葡萄酒提供应用研究基础。