加工对铁皮石斛中8种神经毒性农药残留的影响

凌淑萍,吕 燕,付 岩,张 亮,王全胜,吴银良*

(1.宁波市农业科学研究院,浙江宁波 315040;2.宁波市特色农产品质量安全检测与控制重点实验室,浙江宁波 315040)

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)是我国一种名贵中药材,为兰科多年生草本植物,茎可入药[1]。《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版记载,铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热等功效[2]。作为一种药食同源的作物[3],近年来需求量逐年增加。2020年上半年铁皮石斛出口量和出口价值分别为13 t和12.08万美元。为保护铁皮石斛种质资源,对其进行人工栽培,才可以满足日益增长的需求[4]。现有登记农药种类与中药材病害防治需求相差巨大,导致非登记农药乱用,甚至高毒禁限用农药滥用现象存在,造成中药材上的农药残留污染[5],可能对人体健康存在潜在的风险。具有神经毒性的农药可损害包括皮质、海马、纹状体在内的大量中枢神经系统,大剂量接触后可导致头昏、头痛、恶心、呕吐,严重者发生抽搐、昏迷甚至死亡[6]。此外有机磷农药在长期、低剂量暴露情况下,可致认知功能发生损伤,这种损伤常被忽视,但对患者生活和工作可造成严重影响,甚至进展为阿尔茨海默病及帕金森病等不可逆性的神经退行性病变[7]。目前铁皮石斛中农药检测的方法有气相色谱、三重四极质谱法、液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质谱法等[8-10]。此外,Fu等[11]使用HPLC-MS/MS分析了戊唑醇、肟菌酯等12种农药并进行暴露评估。唐靖雯等[12]对贵州铁皮石斛叶的质量及安全进行评价。

铁皮石斛鲜品内部含水量较高,易霉变,不易保存和运输,根据《中国药典》2020年版,铁皮石斛采收后,除去杂质,剪去部分须根,边加热边扭成螺旋形或弹簧状,烘干;或切成段,干燥或低温烘干,前者习称“铁皮枫斗”(耳环石斛),后者习称“铁皮石斛”[2]。喻明军等[13]开发了铁皮石斛低温烘烤法,使得铁皮石斛的活性成分更好保留。近年来,对铁皮石斛加工利用方式增多,铁皮石斛产品种类增加。如孙传伯等[14-15]研制出铁皮石斛酒;施蕊等[16]将石斛叶提取物制成浸膏;陆倩倩等[17]以铁皮石斛、青钱柳和玫瑰茄为原料,研制出液体口香糖;周兵等[18]将铁皮石斛制成茶包,方便饮用。魏练平等[19-20]提取铁皮石斛中的活性物质制备成护眼和抗癌药物,目前铁皮石斛市场依然以传统的铁皮枫斗为主[21]。虽然铁皮石斛鲜条采收后,会进行简单的清洗和搓皮,这些过程只能去除表面部分的农药残留,而克百威、吡虫啉等有些农药具有内吸性,通过清洗和搓皮不能被有效去除。但是烘烤过程会使作物中的农药残留水平发生变化[22]。铁皮枫斗加工过程最主要的是烘烤,而烘烤对铁皮石斛农药残留加工因子的研究鲜见报道。该研究主要考察吡虫啉、阿维菌素、茚虫威等8种具神经毒性的农药及其代谢物通过模拟鲜条制作成铁皮枫斗的加工方式,在经12、24和48 h烘烤后,用UPLC-MS/MS测定残留量并计算加工因子。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂Acquity UPLC-Xevo TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪、色谱柱Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美国Waters公司);KS4000ic恒温振荡器、T25高速匀浆机、GENIUS3旋涡混合器(德国IKA公司);3K15高速离心机(德国Sigma公司);PL1502E电子天平、XPE205十万分之一电子天平(美国Mettler Toledo公司);BAO-150A鼓风干燥箱(美国STIK公司)。

3-羟基克百威(纯度97.16%)、啶虫脒(纯度99.7%)、阿维菌素(纯度95.3%)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(纯度96.42%)、吡虫啉(纯度99.2%)、茚虫威(纯度98.5%)标样购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;克百威(浓度1 g/L)购于上海安谱实验科技股份有限公司;毒死蜱(浓度1 g/L)、三唑磷(浓度1 g/L)购于上海市农药研究所有限公司;乙腈(色谱纯,德国默克公司);甲酸(色谱纯,阿拉丁生物科技股份有限公司); 硫酸镁(分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司);乙酸钠(分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 农药残留加工因子测定采收的石斛鲜条去除根部、叶片、叶梢和花序残留部分,清洗干净,放在通风阴凉处晾干。整个茎部分用不锈钢刀切成小段,并在不锈钢盆中充分混匀,称取一定量的混匀样品,定量添加8种农药和1种代谢物(3-羟基克百威)的标准溶液,克百威母体与其代谢物单独添加测定。添加后混合均匀,于70 ℃烘烤,在1和24 h分别取样,停机4 h,再烘烤24 h,共3次,分别装入封口样品容器中,贴好标签,冷冻保存。试验重复3次。

为了能够直观地表示残留在加工前后降低或浓缩的情况,通常采用加工因子(processing factor,PF)来表示。加工因子计算公式为:PF=加工食品中农药残留量/初级农产品中农药残留。

1.3 实验室样品制备。

(1)铁皮石斛鲜条市场样品。去除根部、叶片、叶梢和花序残留部分,整个茎部分用不锈钢刀切碎,并在不锈钢盆中充分混匀,用四分法缩分样品,装入封口样品容器中,贴好标签。

(2)铁皮石斛干样。将枫斗磨成粉末后装入样品盒中,贴好标签。

1.4 样品前处理方法50 mL离心管中加入一颗陶瓷均质子,再分别称取铁皮石斛鲜样5.0 g、干样2.5 g置于离心管中,鲜样加入纯净水5.0 mL,干样加入纯净水12.5 mL,振荡混匀,静置30 min,加入20.0 mL乙腈剧烈振荡1 min,加入 6 g无水硫酸镁、1.5 g乙酸钠,剧烈振荡1 min,再以4 200 r/min离心5 min。定量吸取上清液至内含除水剂和净化剂的塑料离心管中,每1 mL提取液用150 mg无水硫酸镁、50 mg PSA和50 mg C18,涡旋混匀1 min。吸取上清液0.5 mL至另一试管中,用0.1%甲酸溶液定容至1.0 mL,混合均匀,过0.22 μm滤膜后供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.5 标准溶液配制分别称取9种农药标准品,用乙腈溶解并定容,分别配成质量浓度为1 000 mg/L标准储备液。用乙腈将标准储备液稀释成100 mg/L标准中间液,于-20 ℃避光保存。用前处理方法制备的铁皮石斛空白样品基质稀释液将标准溶液逐级稀释成质量浓度为0.100 0、0.050 0、0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 mg/L的铁皮石斛基质标准工作溶液。

1.6 仪器条件色谱柱为Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm); 流动相A相为0.1%甲酸溶液,B相为乙腈; 梯度洗脱条件:B相在1.0 min内保持50%后,在0.1 min内增至80%,保持4.9 min,然后在0.1 min内降至50%,保持1.9 min; 流速0.20 mL/min;进样量10 μL。电喷雾电离源正离子模式电离; 多反应监测(MRM); 毛细管电压2.5 kV; 射频电压0.5 V; 离子源温度150 ℃; 脱溶剂气温度500 ℃; 锥孔气流速50 L/h; 脱溶剂气流速1 000 L/h,其他质谱参数见表1。

表1 农药分析的质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters for pesticide analysis

2 结果与分析

2.1 标准溶液曲线与灵敏度用铁皮石斛干样空白基质稀释液将9种标准溶液稀释成不同质量浓度的基质标准工作溶液,按“1.6”仪器条件进样检测,得到峰面积(y)与进样浓度(x,mg/L)的线性回归方程,并计算基质效应。结果表明,在浓度范围内,各化合物峰面积与浓度线性关系良好,线性回归方程、相关系数(r)和基质效应如表2所示。在上述条件下,根据标准曲线最低档浓度(0.000 1～0.000 5 mg/kg)和进样量(10 μL),计算得到各农药最小检出量为1.0×10-12～5.0×10-12g。由于大部分农药存在明显的基质效应,为了更精确定量,选择基质匹配标准溶液进行定量。8种农药及其代谢物的典型离子色谱图如图1所示。

表2 8种农药及其代谢物的线性方程、相关系数和基质效应Table 2 Linear equation,correlation coefficient and matrix effect of 8 pesticides and their metabolite

图1 8种农药及其代谢物的典型离子色谱图Fig.1 Typical ion chromatograms of 8 pesticides and their metabolites

2.2 添加回收率与相对标准偏差该研究基于QuEChERS作为前处理,优化净化条件、MS/MS参数和流动相体系,建立超高效液相色谱-串联质谱检测分析方法。按照“1.4”方法进行前处理。添加浓度为0.01、0.10和1.00 mg/kg,每个添加浓度重复5次,进行添加回收试验,按“1.6”仪器条件进样检测。结果表明,当9种化合物在铁皮石斛中的添加浓度为0.01 mg/kg时,添加回收率在60%～120%,RSD≤20%;添加浓度为0.10～1.00 mg/kg时,添加回收率在70%～110%,RSD≤15%;表明该方法具有较高的回收率和精密度,可满足农药残留检测要求。

2.3 加工因子测定该研究对铁皮石斛加工过程中8种神经毒性农药及其代谢物进行残留动态研究,以加工因子表示。结果表明(表3),70 ℃条件下,烘烤12 h,加工因子普遍较高,排前3位的化合物为茚虫威、三唑磷和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐,平均值分别为5.5、4.8和4.8;烘烤结束(48 h),所有化合物的加工因子在1.0～3.0。

表3 铁皮石斛农药残留加工因子Table 3 Processing factor of the pesticides residues in D.officinale

3 结论与讨论

该研究主要通过模拟铁皮石斛加工工艺,将鲜样于70 ℃条件下烘烤12～48 h,研究8种神经毒性农药及其代谢物残留变化规律。结果表明,在70 ℃条件下,烘烤12～48 h,上述8种农药及其代谢物均表现为浓缩效应。烘烤12 h,农药的残留量最高,说明前12 h以脱水浓缩效应为主。且随着烘烤时间的延长,水分流失减小,残留量呈降低趋势。烘烤48 h,上述所有农药的加工因子在1.0～3.0。适当地延长烘干时间可降低上述农药的残留。然而石斛茎切片干的制作烘烤时间要远小于传统铁皮枫斗的烘烤时间,另外还有低温烘烤模式的发明和使用,使其农药的残留量只会呈现出更明显的浓缩效应。因此,铁皮石斛干样的烘烤制作过程并不能使大部分农药残留量减少。虽然清洗和搓皮可以去除表面残留的农药,但对于内吸性的农药,要结合作物的发育阶段和病虫害的严重程度,合理确定农药的使用时间,才能最大程度地减少农药残留。将此次试验加工因子应用于石斛鲜条初级农产品的农药监测,可估算制成石斛干样农药最终残留,避免没有达到安全采收期就采收的现象。此外将加工因子数据纳入膳食暴露评估模型,可优化膳食评估方法,从而提高评估准确性。该研究为石斛产业的健康发展提供有益借鉴。