羊混合感染羊肠道病毒和多杀性巴氏杆菌的实验室诊断

孙丰兰，王汝都

（1. 淄博市动物疫病预防与控制中心，淄博 255000；2. 河南农业职业学院，郑州 451450）

羊肠道病毒（Caprine enterovirus，CEV）为新发现的病毒性传染病致病原，其最早于2012 年在匈牙利被首次发现并报道［1］，国内于2014 年在腹泻羊群中首次分离到流行毒株并完成基因测序［2］。羊肠道病毒属于微RNA 病毒科肠道病毒属成员，其主要危害羊的消化系统，临床表现出发热、严重腹泻、流涎等症状，是当前羊群病毒性腹泻疫病的主要致病原之一［3-5］。多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是一类畜禽、野生动物、人类均易感的急性、接触性传染病致病原，为条件性致病菌，当外界温度降低、长途运输、应激及机体抵抗力下降时可以诱发动物感染［6-8］。多杀性巴氏杆菌的发生没有季节性，呈散发和地方性流行，不同年龄、性别的羊都可以感染，一般在养殖场环境卫生条件差、应激等因素下容易发生羊多杀性巴氏杆菌感染，羊发病后表现为发热、精神沉郁、食欲下降和腹泻，病羊极易发生营养不良，衰竭而亡，且多杀性巴氏杆菌常常与其他的细菌病、病毒病发生混合感染，加大了疾病感染后的死亡率［9-10］。羊肠道病毒和多杀性巴氏杆菌均是当前威胁我国养羊业健康发展的主要疫病，2022 年10 月，山东某存栏肉羊300只左右的羊场部分羊只突发疾病，零星出现发病死亡情况，发病羊临床表现为呼吸困难、精神沉郁、严重腹泻、不食、消瘦，发病率在40%左右。共有3 只羊发生脱水死亡，将病死羊剖检可见肺部积液、脾脏、淋巴结及肠道组织出血。为了确定发病羊场的致病原，本研究开展了羊肠道病毒PCR 检测与序列分析、多杀性巴氏杆菌分离与鉴定等实验室诊断，现将整个诊断过程汇报如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源

选择3 只病死羊中的1 只进行解剖，无菌采集淋巴结、脾脏、肠道作为临床病料用于病毒检测，无菌采集病死羊的肺脏用于细菌分离培养。

1.2 试剂、试剂盒

病毒基因组提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、一步RT-PCR 扩增试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，细菌生化鉴定管购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 病毒PCR 检测与序列分析

1.3.1 病料样品处理及核酸提取

将无菌采集的淋巴结、脾脏、肠道各取一小块，混合后，按1∶5 体积比加入灭菌生理盐水，同时用研磨器研磨成组织匀浆，离心机12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，利用病毒基因组提取试剂盒提取核酸。

1.3.2 合成引物

参照董坤等［11］建立的羊肠道病毒RT-PCR 检测方法设计合成羊肠道病毒特异性检测引物（上游引物F：5'-CTTTGCACGCCTGTTTTCC-3'，下游引物R：5'-CACACGCTCGGAGGTTGGGAT-3'），其预期扩增片段大小约为497 bp。

1.3.3 RT-PCR 扩增

利用合成的羊肠道病毒检测引物对提取的病料核酸进行一步法RT-PCR 扩增，扩增体系：2×Buffer 12.5 μL、酶0.5 μL、上游和下游引物各0.5 μL、核酸3.0 μL、H2O 8.0 μL。扩增程序：50℃45 min；95℃5 min；94℃45 s，54℃45 s，72℃45 s，35 个循环；72℃10 min。PCR 扩增结束后经核酸电泳观察结果。

1.3.4 序列分析

涉及“图”的高考试题当下正盛行,主要表现为化学实验装置图、电化学工作原理图、坐标图像、图表和化学工艺流程图等形式,尤其是化学工艺流程图以大题的形式连续出现在了最近两年的高考试题中。训练并提高读图能力,方可确保解题思路畅通。

将PCR 阳性扩增产物回收纯化后连接至PMD18-T载体，送生工生物（上海）股份有限公司进行序列测定，将测序结果利用NCBI 中的BLAST 进行在线序列比对分析。同时利用DNAStar 软件将测序结果与GenBank 中登录的不同种群肠道病毒基因序列进行比较，构建遗传进化树。

1.4 细菌分离与鉴定

1.4.1 细菌分离培养与形态特征观察

将无菌采集的肺脏分别接种营养肉汤、血清琼脂培养基、血液营养琼脂，观察细菌培养情况。将分离菌株进行革兰染色镜检，观察细菌形态特征。

1.4.2 生化鉴定

将分离菌株做常规生化试验，鉴定细菌的生化特性。

1.4.3 荚膜基因型PCR 鉴定

（1）核酸提取。利用细菌基因组提取试剂盒提取分离菌株的核酸。

（2）合成引物。参照杨晶晶等［12］的羊多杀性巴氏杆菌荚膜基因型鉴定方法分别合成A 型（上游引物F：5'-TGCCAAAATCG-CAGTCAG-3'，下游引物R：5'-TTGCCATCATTGTCAG-TG-3'）、B 型（上游引物F：5'-CATTTATCCAAGCTCCA-CC-3'，下游引物R：5'-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3'）、D 型（上游引物F：5'-TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3'，下游引物R：5'-CATCTACCCACTCAACCATATC-AG-3'）、E 型（上游引物F：5'-TCCGCAGAAAATTATTG-ACTC-3'，下游引物R：5'-GCTTGCTGCTTGATTTTGTC-3'）、F 型（上游引物F：5'-AATCGGAGAACGCAGAAATCAG-3'，下游引物R：5'-TTCCGCCGTCAATTACTCTG-3'）特异性鉴别引物，预期扩增片段大小分别约为1 044、760、648、511和851 bp。

（3）PCR 扩增。利用合成的荚膜基因型鉴定引物分别对提取的分离菌株核酸进行PCR 扩增，扩增体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游和下游引物各0.5 μL，核酸3.0 μL，H2O 8.5 μL。扩增程序：95℃5 min；95℃45 s，52℃45 s，72℃45 s，35 个循环；72℃10 min。PCR 扩增结束后经核酸电泳观察结果。

2 结果与分析

2.1 病毒PCR 检测与序列分析

2.1.1 RT-PCR 扩增

利用羊肠道病毒检测引物对病料样品核酸进行一步法RT-PCR 扩增，结果如图1 所示。扩增产物片段大小为497 bp 左右，与预期大小一致，显示羊肠道病毒为阳性。

图1 羊肠道病毒RT-PCR 扩增

2.1.2 序列分析

测序结果经BLAST 序列比对，发现为羊肠道病毒特异性核酸序列，与CEV-JL14 毒株同源性100%。利用DNAStar 软件将测序结果（命名为N 序列）和不同种群肠道病毒基因序列构建遗传进化树，结果如图2 所示。N 序列、CEV-JL14 毒株序列与G 种羊肠道病毒处于进化树的同一个小分支，而与E 种、F 种肠道病毒属于另一个不同的小分支。这从分子水平上证实了N 序列为G 种羊肠道病毒。

图2 序列N 与其他毒株的进化树分析

2.2 细菌分离与鉴定

2.2.1 细菌分离培养与形态特征观察

将采集的病料样品接种营养肉汤24 h 后可见肉汤浑浊，管底有沉淀；在血清琼脂培养基长出菌落，在光折射下可见蓝绿色荧光；在血液琼脂培养基上长出表面光滑湿润的圆形菌落，没有发生溶血。将分离菌株革兰染色镜检，显微镜下可见革兰阴性小杆菌，菌体两级着色，有荚膜。符合多杀性巴氏杆菌的培养特征和形态特征。

2.2.2 生化鉴定

由表1 可看出，分离菌株符合多杀性巴氏杆菌的生化特征。

表1 分离菌生化鉴定

2.2.3 荚膜基因型PCR 鉴定

由图3 可知，荚膜A 型引物的PCR 扩增产物片段大小为1 044 bp 左右，与预期大小一致，而荚膜B 型、D型、E 型、F 型的PCR 扩增产物均无特异性扩增条带，表明分离菌株为荚膜A 型多杀性巴氏杆菌。

图3 多杀性巴氏杆菌荚膜基因型PCR 扩增结果

2.3 综合诊断

综合判断可以认为，发病羊死亡原因为G 种羊肠道病毒和荚膜A 型多杀性巴氏杆菌混合感染所致。

3 讨论

鉴于过去肠道病毒对畜禽和人类健康的危害，羊肠道病毒一经流行就引起了我国研究者的密切关注。鲁桂侠［13］采用RT-PCR 方法对河北省采集的266 份羊粪便样品进行羊肠道病毒感染的病原学检测与分析，结果表明，羊肠道病毒平均阳性感染率达27.82%。魏艳华等［14］采用RT-PCR 方法对山东聊城东昌府区采集的292 份羊粪便样品进行羊肠道病毒核酸检测和序列分析，共检测出羊肠道病毒阳性样品12 份，平均阳性率达4.11%，且12份阳性样品均为G 种羊肠道病毒。刘汉胜［15］从甘肃省某羊场暴发的临床表现出严重腹泻、精神萎靡、逐渐消瘦为症状的发病羊群中分离到1 株病毒，序列分析鉴定表明，分离毒株为G 种羊肠道病毒。王汝都等［16］从河南省某腹泻羊场的粪便样品中分离出2 株病毒，序列分析鉴定表明，2 株分离毒株均为G 种羊肠道病毒。本研究采用RT-PCR 扩增和序列测定方法对临床病例进行了分子水平上的检测，结果表明，临床病例也为G 种羊肠道病毒感染，结合前人的上述研究结果，说明当前我国羊肠道病毒的感染较为严重，且G 种羊肠道病毒为国内当前流行的优势基因型，临床中应进一步加强羊肠道病毒的诊断及监测，为疾病防控奠定基础。由于羊肠道病毒为一种新发动物传染病，目前尚无有效的疫苗防控，也没有有效的治疗药物，发生感染后应立即采取隔离、净化措施，以防止本病在羊场扩散流行。

多杀性巴氏杆菌病是牛羊均易感的细菌性传染病，感染的羊是主要传播来源，病羊的分泌物、排泄物会不断传播病菌，羊感染多杀性巴氏杆菌根据临床表现分为最急性型、急性型和慢性型［17］。根据多杀性巴氏杆菌荚膜抗原不同，可分为5 个荚膜基因型（A 型、B 型、D 型、E型、F 型），目前我国羊群主要流行A 型、B 型、D 型，不同荚膜基因型之间无交叉保护性或交叉保护率较低，导致不同荚膜基因型的疫苗之间免疫效果不理想［18-19］，不同地区应根据当地流行的优势荚膜基因型合理选择疫苗。因此，准确鉴定本地区甚至本场的流行菌株荚膜基因型对综合防控措施的制定至关重要。在本病例中，根据临床特征初步判定为急性型多杀性巴氏杆菌，为了进一步确诊，本研究进行了细菌分离培养与荚膜基因型PCR 鉴定，结果表明分离菌株为荚膜A 型Pm，为该场发病羊群及时采取针对性治疗措施提供了参考。

混合感染导致疫病临床症状更加复杂，危害程度和经济损失更大，诊断和治疗方法更加困难，且仅通过临床特征很难确诊致病原，导致治疗措施不合理、不及时，进而会加重疫病的危害程度，故借助实验室诊断进行确诊至关重要。本研究通过分子生物学方法在分子水平上确诊致病原为G 种羊肠道病毒和荚膜A 型多杀性巴氏杆菌混合感染。至于是羊肠道病毒在羊群发病过程中起主导作用，还是多杀性巴氏杆菌在羊群发病过程中起主导作用，尚不明确。但无论是羊群先感染羊肠道病毒，还是先感染多杀性巴氏杆菌，都与羊场的生物安全防控措施密切相关，只有在日常饲养管理中加强生物安全防控措施，提高整体生物安全防护水平，才能有效避免疫病的发生。

4 结论

本研究通过病毒PCR 检测与序列分析、细菌分离与鉴定，确诊病羊死亡原因为G 种羊肠道病毒和荚膜A 型多杀性巴氏杆菌混合感染所致。