甜瓜高效不定芽再生体系的建立

贺玉花，徐龙兰，唐伶俐，徐永阳，田小琴，张 健，孔维虎，李文东，赵光伟

（1.中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009；2.三亚中国农业科学院国家南繁研究院 海南三亚 572000；3.潍坊创科种苗有限公司 山东昌乐 262400）

甜瓜（Cucumis meloL.）属于葫芦科甜瓜属，是世界上重要的园艺经济作物之一。我国是世界甜瓜生产和消费第一大国，据联合国粮食与农业组织（FAO）统计数据，2021 年我国甜瓜种植面积为38.66 万hm2，产量达1400 万t，占世界总产量的49%。当前甜瓜育种多依赖杂交、回交等传统育种手段，存在育种周期长、盲目性大、改良数量性状效果较差等缺点[1-2]。与传统育种相比，分子育种更精准高效，是当前和未来甜瓜育种中的重要策略。解析基因功能是开展分子育种的前提，遗传转化是进行基因功能验证、明确基因功能最直接的手段，而构建甜瓜高效不定芽再生体系是实现遗传转化的基础。

甜瓜不定芽再生体系受基因型、外植体类型、植物生长调节剂的种类与浓度等因素的影响。不同基因型甜瓜的内源激素水平存在差异，因而其再生能力也有所不同[3-4]。研究表明，不同基因型甜瓜间再生率差异显著，且薄皮甜瓜再生率要高于厚皮甜瓜[5-10]。选择不定芽诱导能力较高的外植体类型，是建立再生体系的关键。而不同类型的外植体，其细胞结构和种类存在一定差异，未分化的分生组织及分化程度较低的薄壁组织细胞更适于诱导再生[11-12]。前人研究发现，甜瓜的各个部位均可用于组织再生获得完整植株，其中子叶、下胚轴使用较多[5，13-17]。另外，植物生长调节剂的种类和浓度是影响外植体分化的重要因素，常用于甜瓜再生的植物生长调节剂有6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。在不定芽诱导阶段，一般均需添加6-BA，添加质量浓度一般在0.5～2.0 mg·L-1，添加少量的IAA 或ABA能够更好地平衡内源激素水平，提高不定芽再生率[17-20]。不添加植物生长调节剂也可以实现不定芽的伸长和生根，再生率约为70%[21-22]，而添加少量的植物生长调节剂能够促进不定芽伸长和生根，并且缩短再生时间。添加低质量浓度的6-BA（0.05～0.5 mg·L-1）能够促进不定芽伸长且降低玻璃化程度，再生苗状态较好，再生率为80%左右[3，18-19，23-24]。以1/2 MS 培养基为基础，添加少量IAA 或IBA（0.2～0.5 mg·L-1最佳），能够促进不定芽生根[16-20，25-26]。

尽管甜瓜再生体系构建已有不少报道，但在甜瓜离体再生过程中仍存在愈伤组织分化出芽困难、不定芽诱导率低和再生体系重复性差等问题。笔者以8 个甜瓜基因型为试验材料，通过对甜瓜基因型，外植体类型，不定芽诱导、伸长及不定根诱导过程中植物生长调节剂种类和质量浓度等关键影响因素进行探究，以期筛选出再生能力强、不定芽再生率高的甜瓜基因型并建立重复性高的甜瓜不定芽再生体系，为甜瓜遗传转化体系的建立提供一定科学依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料及地点

试验材料共8 份不同的甜瓜种质，包括3 个厚皮甜瓜材料：B8（红心脆，原新疆地方品种）、P110（Vedrantais，原法国材料）、905（引自西甜瓜中期库，原美国品种PMR45）；5 个薄皮甜瓜材料：IVF05（引自中国农业科学院蔬菜花卉研究所）、E5（甜宝，原日本材料）、E55（牛角蜜，原地方品种）、E79（白沙蜜，原地方品种）、974（黄皮梨瓜，原地方品种）。材料均经中国农业科学院郑州果树研究所甜瓜遗传育种课题组连续多代自交纯化。

试验于2021 年9 月至2022 年3 月在中国农业科学院郑州果树研究所遗传转化实验室进行。

1.2 方法

1.2.1 种子处理 挑选状态健康的甜瓜种子，加适量常温无菌水浸泡30 min 后剥去外种皮，移至超净工作台后，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用2%的次氯酸钠浸泡15 min（其间不断摇晃），无菌水冲洗4～5 次，播种于1/2 MS 培养基上，在正常光周期条件（25 ℃，光照16 h·d-1，黑暗8 h·d-1，光照度3000 lx）下培养3 d，至子叶由黄转绿时获得无菌苗。

1.2.2 不定芽的诱导培养 选择上述8 个基因型的甜瓜材料分别获取无菌苗，将无菌苗子叶沿腹缝线远胚轴端划开（图1），开口深度为0.5 cm 左右，接种于添加不同质量浓度的6-BA 和ABA（设置10 个组合，具体处理见表1）的MS 培养基上，在正常光周期条件下培养，进行不定芽诱导，观察不定芽诱导情况。每个处理3 个培养皿，每个培养皿接种10 个外植体，14 d 继代1 次，28 d 后统计出芽情况，计算不定芽出芽率。根据不定芽出芽率，筛选再生能力最佳的基因型及不定芽诱导阶段最适培养基。

图1 外植体处理示意图Fig.1 Diagram map of cotyledon treatment

不定芽出芽率/%=出芽外植体个数/接种外植体个数×100。

1.2.3 外植体类型的筛选 选择再生能力最佳基因型材料和最适培养基，设置子叶近胚轴端、子叶远胚轴端和胚轴3 种外植体（图2），对其不定芽诱导能力进行探究。在无菌环境下去除无菌苗生长点、根系及大部分胚轴，保留子叶和2 cm 左右胚轴，同时将子叶垂直叶脉切割，分成近胚轴端和远胚轴端两部分。将不同类型的外植体接种于最适不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导。每个外植体类型3 个培养皿，每个培养皿接种10 个外植体，14 d 继代1 次，28 d 后观察不定芽诱导情况，计算不定芽诱导率，筛选最佳外植体类型。

图2 外植体类型示意图Fig.2 Diagram map of cotyledon types

1.2.4 不定芽伸长 不定芽诱导28 d 后，将生长状态较好的不定芽丛切下，转移至MS 伸长培养基上，在正常光周期条件下培养，设置添加6-BA 质量浓度梯度0.1（处理A）、0.2（处理B）、0.5（处理C）、1.0 mg·L-1（处理D）4 个处理，每个处理设置3 个培养皿，每个培养皿接种10 个不定芽。21 d 后观察不定芽丛伸长情况，确定不定芽伸长最适培养基。

1.2.5 不定根诱导 不定芽伸长至2～3 cm、具有3～4片真叶时，将其转移至1/2 MS 生根培养基上进行不定根诱导。设添加IBA 质量浓度梯度0.0、0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1等5 个处理（A～E），每个处理3 次重复，每个重复10 个不定芽。培养14 d 后观察生根情况。

1.3 统计与分析

利用Excel 2016 和SPSS Statistics 26 进行试验数据统计及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同基因型及植物生长调节剂质量浓度配比对甜瓜不定芽诱导的影响

基因型和植物生长调节剂直接影响不定芽诱导率，试验以8 个基因型甜瓜为研究对象，对10 个不同组合的培养基进行不定芽诱导，28 d 后统计出芽率（表1）。结果表明，4 个薄皮基因型甜瓜（E5、E55、E79、974）的平均出芽率分别为23.3%、20.7%、31.0%、35.3%，显著低于厚皮基因型甜瓜B8、P110和薄皮基因型甜瓜IVF05，其中除E79 在处理5 的出芽率为80.0%、974 在处理3 的出芽率为83.3%外，4 个薄皮基因型甜瓜（E5、E55、E79、974）在其他处理条件下的出芽率均低于60.0%，表明4 个薄皮基因型甜瓜（E5、E55、E79、974）的再生能力较弱。905 只有在处理6、7 和处理10 条件下出芽率高于60.0%，且其平均出芽率低于50.0%，表明905 的再生能力也较弱。而B8、P110 和IVF05 的平均出芽率均在55.0%以上，再生能力较强，其中B8 诱导再生获得的不定芽丛长势好，单芽多，再生苗状态较好，是更合适的再生材料。

处理1 和处理2 只添加了6-BA，其平均出芽率显著低于其他另外添加了ABA 的处理，表明添加一定量的ABA 能促进甜瓜不定芽诱导。处理3和处理9 的平均出芽率均为53.8%，高于其他处理，且B8、P110 和IVF05 均可在处理9 下获得最高出芽率，分别为96.7%、86.7%和93.3%，因此选择处理9 培养基（MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA）为不定芽诱导的最适培养基。

2.2 不同外植体类型对甜瓜不定芽再生的影响

与先诱导愈伤组织再诱导不定芽的间接再生相比，直接诱导产生不定芽的直接再生方式可以缩短转化进程，因此，外植体应选择产生不定芽数量多的类型。以B8 为研究对象，MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA 为不定芽诱导培养基，观察3种外植体的再生能力，28 d 后统计不定芽出芽率。结果如表2 所示，胚轴做外植体诱导产生大量愈伤组织，诱导出芽率极低，是不适合的外植体类型。以子叶近胚轴端做外植体，出芽率为93.3%，显著高于其他2 种外植体，且产生愈伤组织较少，因此，子叶近胚轴端是最适合用于不定芽再生的外植体类型。

表2 不同外植体类型对B8 不定芽再生的影响Table 2 Effect of different explant types on adventitious bud regeneration in B8

2.3 植物生长调节剂对不定芽伸长的影响

以B8 为研究对象，设置4 个不同质量浓度6-BA 处理（A～D），在不定芽诱导21 d 后观察不定芽伸长情况（图3），并统计单芽数量（表3）。结果表明，添加不同质量浓度的6-BA，丛生芽均可得到伸长，各处理间不定芽伸长量没有明显差异，但随着6-BA 质量浓度逐渐升高，发现获得的单芽数量逐渐减少，当6-BA 添加质量浓度为0.1 mg·L-1时，获得的伸长单芽数为16.3，显著高于其他处理。在不定芽伸长量正常的基础上，单芽数量越多，越有利于切割出更多的无菌苗用于后期生根。因此，B8材料不定芽伸长阶段最适培养基配比为MS+0.1 mg·L-16-BA。

表3 不同质量浓度6-BA 处理对B8 不定芽伸长的影响Table 3 Effect of different concentrations on adventitious bud extensions in B8

图3 不同浓度6-BA 对B8 不定芽伸长的影响Fig.3 Effects of different concentrations of 6-BA on the extension of adventitious buds in B8

2.4 植物生长调节剂对不定根诱导的影响

以B8 为研究对象，设置5 个不同质量浓度IBA 处理（A～E），在不定根诱导14 d 后观察不定根诱导情况（图4），并统计生根率和平均主根数（表4）。结果表明，不同的处理条件下再生苗生根率均较高（均在85.0%以上），但诱导产生的根系形态及数量有明显差异。处理A 产生根系数量不稳定，大多数根系仅含有一条主根，侧根较多。处理B 和处理C 的主根数量有一定的增加，但发育较好、侧根发达的主根数量相对较少。处理D 平均主根数量为3.1，显著高于其他处理，且根系发育好、侧根发达，是最佳的生根处理。处理E 不定根生长受到抑制，平均主根数仅为0.9。综上，IBA 的适量添加可以促进不定根的产生，但质量浓度过高（1.0 mg·L-1）会抑制生根，当添加质量浓度为0.5 mg·L-1时，促进生根效果最好，1/2 MS+0.5 mg·L-1IBA 是较合适的不定根诱导培养基。

表4 不同质量浓度IBA 处理对B8 不定根诱导的影响Table 4 Effect of different concentrations in the rooting of adventitious buds in B8

图4 不同质量浓度IBA 对B8 不定根诱导的影响Fig 4 Effect of different concentrations of IBA on the rooting of adventitious buds in B8

3 讨论与结论

稳定且高效的再生体系是遗传转化成功实现的前提。植物再生分为通过诱导愈伤组织的间接再生和通过诱导不定芽的直接再生，甜瓜中主要采用直接诱导再生的方式。甜瓜不定芽再生体系受基因型、外植体类型、植物生长调节剂的种类与浓度等因素的影响。笔者研究发现，2 个厚皮甜瓜材料（B8、P110）和1 个薄皮甜瓜材料（IVF05）不定芽诱导能力均较强，平均出芽率显著高于其他4 个薄皮甜瓜基因型材料（E5、E55、E79、974），这与前人得出的薄皮甜瓜再生率高于厚皮甜瓜的结论不同[7-10，12]。笔者认为，这与试验中所选材料不同有关，对于甜瓜厚皮材料与薄皮材料的再生能力的强弱并没有定论。

在诱导外植体直接再生的过程中添加适量的植物生长调节剂可以提高外植体出芽率，同时提高不定芽的伸长速度和新生苗生根率，从而缩短再生周期。不定芽诱导阶段一般会添加6-BA，同时添加少量的IAA、ABA 能获得更好的效果，不定芽诱导率在70%～90%[3，18，24，27-28]。笔者在本研究发现，对于8 个不同基因型材料，出芽率最高的培养基均添加了少量的ABA，表明在不定芽诱导过程中，添加适量的ABA 能够促进不定芽诱导，这与前人研究结果一致[18，29]，但是对于不同基因型材料，出芽率最高的培养基添加ABA 的质量浓度不同，表明在进行甜瓜再生时，针对不同基因型，应进行预试验，筛选最适合的植物生长调节剂种类与质量浓度。B8 材料在MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA 培养基上进行不定芽诱导，其诱导率高达96.7%，高于前人研究中其他基因型材料的不定芽诱导率。添加少量的植物生长调节剂可以有效促进再生芽的伸长，而笔者研究发现不同质量浓度6-BA 处理不定芽伸长量并没有明显差异，这与Zhang 等[30]的研究结论一致，但0.1 mg·L-16-BA 处理产生的单芽数量显著高于其他3 个处理。

甜瓜的子叶、下胚轴均能进行脱分化，再生获得完整植株。在含有STM基因（茎尖分生组织）的干细胞中，分生组织的诱导率更高，生长更快，而子叶中STM基因主要分布在子叶近胚轴端U 型切口的深层细胞中，因此更适于用作再生。笔者在对B8 材料外植体类型的研究中发现，胚轴不定芽诱导率极低，产生大量愈伤组织，而靠近胚轴端的子叶却有着极高的不定芽诱导率，这与前人研究结果一致[28，31]。

综上所述，笔者通过对甜瓜再生过程中基因型、外植体类型、植物生长调节剂种类和浓度等关键影响因素进行研究，筛选出再生能力较强的厚皮甜瓜材料B8，并以其为基础建立了一个稳定高效的甜瓜再生体系，其中再生过程中最佳外植体类型为子叶近胚轴端，不定芽诱导最佳培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1ABA，不定芽伸长最佳培养基为MS+0.1 mg·L-16-BA，不定根诱导最佳培养基为1/2 MS+0.5 mg·L-1IBA。