基于广泛靶向代谢组学的2 种百香果风味差异研究*

袁启凤，颜培玲，史斌斌，陈 楠，王立娟，卢 晨，李仕品

（贵州省农业科学院果树科学研究所，贵阳 550006）

百香果学名西番莲（PassifloraedulisSims.）[1]，目前主要在贵州省低海拔、热量丰富的县区发展，如罗甸、贞丰、从江、榕江等地区。百香果属于“短、平、快”产业，作为“当年种植当年见效”的树种，百香果也从零星种植发展到大面积种植，品种也从以紫果为主的品种发展为黄果等多品种共存的格局，逐步满足了消费者对不同风味的需求。紫果类品种以台农一号为代表，黄果类品种以芭乐味黄金百香果为代表。除贵州省外，福建、广西、云南、海南等省区市也是我国百香果的主产地[2-3]。但不同地区的百香果种植环境、种植模式有所不同，也可能导致同一品种在风味上存在一定的差异。果实风味不但关系到消费者味觉的感受，而且还关系到果品本身的营养价值[4]。百香果富含蔗糖、黄酮、氨基酸、有机酸、维生素等营养物质[5-6]，紫果类品种果实成熟时果皮呈现紫红色，香气浓郁，但口感酸，鲜食率低，黄果类品种果实成熟时果皮为金黄色，酸度低，糖度高，口感为纯甜味，鲜食率高，但香味相比紫果类品种淡[7-8]。

广泛靶向代谢组学分析是一种结合非靶向代谢组学和靶向代谢组学优点的新方法，利用基于多反应监测模式的QTRAP 质谱法，可同时定量数百个已知代谢物和近千种未知代谢物，实现了高灵敏度、广泛靶向代谢物的检测和鉴定[9]。为探明贵州产区紫果类和黄果类百香果风味上的差异，本文基于超高效液相色谱-串联质谱广泛靶向代谢组学的方法对2 种百香果内含物质的代谢物种类及相对含量进行检测，以期找出差异代谢物，并从差异代谢物角度揭示2 种百香果风味差异的原因，为深入研究百香果风味形成机理及定向育种提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为紫果百香果（台农一号）和黄金百香果（芭乐味黄金百香果）。紫果百香果成熟时果皮为紫红色，果形为椭圆形，口感酸甜，香气浓郁；黄金百香果成熟时果皮为金黄色，果形为扁圆形至圆形，口感纯甜，香味偏淡。2 个品种果实采集于贵州省安顺市镇宁县良田镇坝草村贵州省农业科学院果树科学研究所亚热带果树示范基地，均在果实成熟期挑选大小、色泽、成熟度一致且无机械损伤的果实，运回实验室进行处理。

1.2 仪器与试剂

超高效液相色谱（UPLC，Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A）、串联质谱（MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP）、甲醇（色谱纯，Merck）、乙腈（色谱纯，Merck）、乙醇（色谱纯，Merck）、标准品（色谱纯，BioBioPha/Sigma-Aldrich）等。

1.3 试验方法

1.3.1 样本的采集及制备

以紫果百香果和黄金百香果果汁为试材，分为A、B 2 个组进行代谢组分析，每组设3 个重复。将样品分别置于冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥，用研磨仪（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状，称取100 mg 粉末溶解于0.6 mL 的70%甲醇提取液中，溶解后的样品置于4 ℃冰箱中过夜，其间涡旋6 次以提高提取率，10 000 r/min 下离心10 min，取上清，微孔滤膜（0.22µm pore size）过滤样品，保存于进样瓶中用于超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS）分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS 数据采集条件

液相条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8µm，2.1 mm×100 mm；流动相中A为超纯水（含0.04%乙酸），B 为乙腈（含0.04%乙酸）；洗脱梯度为0～10 min，5%～95%B，10～11 min，95%B，11.0～11.1 min，5%B，11.1～14.0 min，5%B；流速条件0.35 mL/min，柱温40 ℃，进样量4µL。质谱条件：电喷雾离子源（ESI）温度550 ℃，质谱电压5 500 V，帘气（CUR）30 psi，碰撞诱导电离（CAD）参数设置为高。在三重四级杆（QQQ）中，根据优化的去簇电压（DP）和碰撞能（CE）对每个离子对进行扫描检测。

1.4 数据分析

混样质控样本（QC）mix01、mix02、mix03 由A 组和B 组百香果混合而成，用于判断代谢物提取和检测的重复性。代谢物定性基于武汉迈维生物技术有限公司自建数据库MWDB（metware database）、代谢物信息公共数据库和二级谱信息完成。运用Analyst 1.6.3 软件处理质谱数据。根据代谢物保留时间与峰型信息，对每个代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。将代谢物数据进行无监督的主成分分析（PCA）和有监督的正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）以观察分组之间和组内样本之间的变异度大小。根据获得的多变量分析OPLS-DA 模型的变量重要性投影VIP 值和差异倍数值（Fold Change，FC）进一步筛选差异代谢物。相对含量采用峰面积归一法进行计算，利用SPSS 22.0 软件分析差异显著性。将差异代谢物映射到KEGG 数据库中进行注释，根据注释结果按照KEGG 通路中的类型进行分类。

2 结果与分析

2.1 百香果广泛靶向代谢组学分析

如表1 所示，紫果百香果和黄金百香果中共检测到代谢产物11 类405 种，包括黄酮类103 种、酚酸类49 种、氨基酸及其衍生物66 种、核苷酸及其衍生物35 种、有机酸31 种、生物碱20 种、糖及醇类21 种、木脂素和香豆素11 种、脂质48 种、维生素8 种、其他13 种；2 种百香果果实检测到共有代谢物、差异显著代谢物分别为366 种和263 种，共有代谢物黄酮类81 种、酚酸类43 种、氨基酸及其衍生物64 种、核苷酸及其衍生物35 种、有机酸29种、生物碱17 种、糖及醇类21 种、木脂素和香豆素10 种、脂质47 种、维生素7 种、其他12 种。紫果百香果代谢产物有383 种，未检测到的黄酮类主要是槲皮素、山奈酚、木犀草素、金合欢素、芹菜素、矢车菊素等11 种糖苷衍生物，酚酸类是异绿原酸B、3-（4-羟基苯基）丙酸、肉桂酸乙酯等3 种，氨基酸及其衍生物是N-（3-吲哚乙酰基）-L-丙氨酸1 种，有机酸是α-羟基异丁酸、3-羟基丁酸等2种，生物碱是N-芥子酰腐胺、N′-阿魏酰腐胺、N-阿魏酰基胍丁胺等3 种，脂质是甘油亚油酸酯1 种，其他是Z-蒿本内酯1 种；黄金百香果代谢产物有388 种，未检测到的黄酮类主要是山奈酚、刺槐素、新奥司明、香叶木素、木犀草苷、香叶木苷、金圣草黄素、圣草次苷等11 种，酚酸类是香兰素、1-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸等3 种，氨基酸及其衍生物是顺式-4-羟基-D-脯氨酸1 种，木脂素和香豆素是东莨菪内酯1 种，维生素是烟酸1 种。本次检测结果发现，2 种百香果虽各自具有一些独特的物质，但主要还是集中体现在黄酮类和酚酸类物质上。

表1 2 种百香果代谢产物数量统计

2.2 主成分分析及聚类分析

将2 种百香果总共405 种代谢产物进行主成分分析，第1 主成分解释了总方差的62.54%，第2 主成分解释了总方差的14.21%，其中3 个紫果百香果样品、3 个黄金百香果样品和3 个质控样品分别独立聚在一起（图版4-A-a）。利用归一化方法UV（unit variance scaling）对代谢产物含量数据进行处理，使用R 软件分析并形成热图，聚类分析代谢物在不同样本间的积累模式如图版4-A-b，结果显示，紫果百香果和黄金百香果代谢产物分别具有相似的积累趋势。主成分分析和层次聚类分析均表明，紫果百香果和黄金百香果之间具有不同的代谢产物特征，这为后续分析差异代谢物提供了基础。

2.3 差异代谢物的筛选与分析

基于OPLS-DA 结果，从获得的多变量分析OPLS-DA 模型的变量重要性投影VIP 值（VIP≥1）和代谢物含量的差异倍数值（FC≥2、FC≤0.5），如图版4-B 所示，2 种百香果筛选到的差异代谢物有163 种（上调80 种、下调83 种）。由表2 可知，紫果百香果和黄金百香果共筛选到11类163种差异代谢物，其中黄酮类72 种（上调31 种、下调41种）、酚酸类28 种（上调15 种、下调13 种）、氨基酸及其衍生物15 种（上调3 种、下调12 种）、核苷酸及其衍生物9 种（上调4 种、下调5 种）、有机酸9 种（上调7 种、下调2 种）、糖及醇类5种（上调4 种、下调1 种）、维生素3 种（上调2种、下调1 种）、脂质6 种（上调5 种、下调1 种）、生物碱8 种（上调5 种、下调3 种）、木脂素和香豆素3 种（上调0 种、下调3 种）、其他5 种（上调4 种、下调1 种）。从数量上看，黄酮类和酚酸类都构成了2 种百香果的主要差异代谢物，与紫果百香果相比，黄金百香果中下调物质多于上调物质。

表2 2 种百香果果实差异代谢物统计

将检测到的代谢产物进行定性分析和定量分析，比较代谢产物定量信息在各分组中发生的差异倍数变化，将差异代谢物的差异倍数进行log2 处理，即将FC 值进行log2 转换之后，FC 值被划分成正、负，可以直观地通过正、负来判断上调、下调，然后根据log2FC 绝对值的大小判断差异强度。若FC原值不进行转换，则结果全是正值，无法直观判断上调还是下调。从表3 可以看出，与紫果百香果相比，黄金百香果变化程度（log2FC）排在前10 位的上调代谢物包括5 种酚酸类、3 种有机酸、1 种黄酮类和1 种生物碱，下调代谢物包括9 种黄酮类和1种酚酸类。从前10 位差异代谢物来看，黄酮类、酚酸类和有机酸构成了2 种百香果的主要差异代谢物质。

表3 2 种百香果差异倍数排在前10 位的代谢产物

差异倍数排在前10 位的上调代谢物包括了3种有机酸，这一现象与黄金百香果实际口感不一致，比较2 种百香果中糖、酸、氨基酸的差异情况（表4）可以发现，黄金百香果中除磷酸葡糖酸下调外，其余4 种糖均上调；而峰面积最大的L-高丝氨酸下调。虽然黄金百香果中上调有机酸种类远远高于下调，但果实中酸甜风味主要取决于糖和酸之间总量平衡关系。此外，呈味氨基酸在果实风味中也发挥比较重要的作用，紫果百香果和黄金百香果中13种氨基酸相对含量差异显著，紫果百香果中11 种氨基酸及其衍生物上调、2 种下调，其中苯丙氨酸、L-天冬氨酸2 种呈味氨基酸显著高于黄金百香果。

表4 2 种百香果中主要的糖、酸和氨基酸代谢差异统计

2.4 差异代谢物KEGG 富集分析

将差异代谢物进行KEGG 富集分析，其中代谢物富集较多且差异显著的通路包括黄酮和黄酮醇类生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）、黄酮类生物合成（Flavonoid biosynthesis）、苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、哌啶和嘧啶生物碱合成（Tropane piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis）、烟酸和烟酰胺代谢（Nicotinate and nicotinamide metabolism）以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（Glycine，serine and threonine metabolism）等（图版4-C）。KEGG 富集分析同样显示，黄酮相关的通路是2 种百香果差异最显著的。

3 讨论与结论

2 种百香果共含有黄酮类、酚酸类、氨基酸类、有机酸类、糖及醇类等405 种代谢产物，其中功能性物质黄酮类、酚酸类种类最多，也是紫果百香果和黄金百香果中差异代谢物数量最多的两类物质，同时2 种百香果各自独有的黄酮类物质也是最多的。百香果作为民间传统药用植物，广泛应用于利尿、止咳、消炎止痛[10-11]。通过差异代谢物筛选，共得到163 种物质，同样以黄酮类（72 种）、酚酸类（28 种）为主。KEGG 富集分析显示，黄酮相关的通路也是2 种百香果差异最显著的。黄酮和酚酸功能复杂，在调节果实风味方面具有很重要的作用，此外，在提高植物抗逆性、影响果实色泽方面也发挥着重要的作用[12-14]。柿、葡萄和核桃内种皮因富含单宁、儿茶素等而具有涩味[15-17]，柚子有明显的苦味是因为富含柚皮苷[18]，新橙皮苷也是柑橘的苦味来源[19-20]。百香果中检测到一定量的新橙皮苷、原儿茶酸，但吃的时候察觉不到苦涩味很可能是被别的物质中和，所以黄酮类和酚酸类物质是如何影响百香果风味的，还需进一步研究。

水果中的糖和有机酸组分及比例是影响果实风味的重要因素[7,21]。百香果果汁中含有丰富的糖和有机酸，2 种百香果中共检测到山梨糖醇、葡萄糖等21 种糖醇以及柠檬酸、琥珀酸等31 种有机酸，其中5 种糖和9 种酸相对含量差异显著。黄金百香果中磷酸葡糖酸下调，耐斯糖、葡萄糖-1-磷酸、海藻糖-6-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸上调；L-高丝氨酸、3,5-二羟基-3-甲基戊酸下调，（S）-2-羟基丁酸、4-乙酰氨基丁酸、5-羟基己酸、2-羟基丁酸、半乳糖醛酸上调；α-羟基异丁酸、3-羟基丁酸独有。虽然黄金百香果中上调代谢物的数量远远高于下调代谢物，但黄金百香果总酸含量低于紫果百香果[22]，所以黄金百香果中上调和独有的7 种酸很可能对总酸的贡献量不大，L-高丝氨酸、3,5-二羟基-3-甲基戊酸2 种酸的下调才是造成黄金百香果总酸含量低于紫果百香果的主要原因。同理，黄金百香果口感甜于紫果百香果，是因为糖含量高，与耐斯糖、葡萄糖-1-磷酸、海藻糖-6-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸4 种糖上调有关[22-23]。氨基酸不仅是食物中重要的营养成分，同时在丰富食物味道方面也起到重要的作用[24-25]，一般意义上把谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸这6 种能呈现出特殊鲜味的氨基酸称为呈味氨基酸。百香果中氨基酸含量丰富，检测到66 种氨基酸及其衍生物，紫果百香果和黄金百香果中15 种氨基酸及其衍生物相对含量差异显著，紫果百香果中12 种氨基酸及其衍生物上调，3 种下调，其中苯丙氨酸、L-天冬氨酸2 种呈味氨基酸显著高于黄金百香果，L-天冬氨酸和苯丙氨酸在食品加工过程中通常作为香味剂、鲜味剂添加使用，因此以苯丙氨酸、L-天冬氨酸为代表的氨基酸的上调是导致紫果百香果香味、鲜味浓于黄金百香果的重要原因[23]。

百香果因其独特香气而备受欢迎，主要是因为含有丰富的芳香类物质[26]。脂质是芳香类物质等挥发性有机物的前体物质，在百香果成熟过程中显著降低[27]。紫果百香果和黄金百香果中6 种脂质含量存在显著差异，紫果百香果中5 种脂质上调、1 种下调，紫果百香果香味更加浓郁很可能与单酰甘油酯、甘油亚油酸酯等5 种脂质的分解上调密切相关。