分泌型卷曲相关蛋白4介导的线粒体自噬在大鼠糖尿病肾病肾间质纤维化中的作用

杨琳 屈晓群 刘敬 潘红菊

(临汾市中心医院肾内科,山西 临汾 041000)

糖尿病肾病(DN)为临床较为常见的一种糖尿病并发症,多发肾小管-间质纤维化、肾小球基底膜加厚、系膜增生,可造成终末期肾病,严重威胁患者的机体健康〔1,2〕。研究显示〔3,4〕,DN多发生于病程超过10年的糖尿病患者,患病率为40%～50%。DN与其他类型的肾病存有一定的差异,由于其并发糖脂代谢失衡,在治疗上提高了难度,临床未发现标准治疗此病的方案,主要是控制血压、血糖及抑制蛋白的摄入,以控制病症的发展速度〔5,6〕。及时预估早期DN且制定出个性化治疗方法以延缓病症的发展是改善患者预后的主要方法。尿微量白蛋白排泄率为临床评估DN的重要标准,但极易受感染等因素的影响,且对肾小球及肾小管的受损状况难以预估〔7〕。分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)4可经特异性结合细胞膜表面的卷曲蛋白的有关受体对肾纤维化的产生与进展进行有效介导〔8〕。本文分析SFRP4介导的线粒体自噬在DN肾间质纤维化中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 雄性SD大鼠由深圳华瑞模式生物科技有限公司提供,7～8 w周龄,体质量200～230 g,平均(215.30±10.05)g,动物许可证号:SYXK(粤)2022-0304;大鼠在清洁环境下给予自由饮水、正常饮食。本试验均由严格按动物实验标准予以操作,且取得医院伦理委员会批准。

1.2建模与分组 大鼠适应性饲养1 w后开始试验,检测尿蛋白和尿糖定性为阴性,大鼠空腹血糖水平均处于正常范围(3.2～7.0 mmol/L)。大鼠不禁水禁食3 h,给予其50 mg/kg链脲佐菌素(STZ)腹腔注射,连续注射5 d,1次/d。建模后2 w对大鼠空腹血糖水平进行测定,以血糖≥16.7 mol/L且尿糖呈阳性视为建模成功,最终有10只大鼠建模完成。另选10只相同鼠龄的正常大鼠作为对照组,腹腔注入同等剂量STZ溶酶无菌柠檬酸钠缓冲液,连续5 d,1次/d。

1.3病理组织学观察 取大鼠部分肾组织通过10%甲醛予以固定(48 h),梯度酒精脱水后,使用二甲苯30 min透明。用石蜡包埋、切片(4 μm),切片经梯度酒精进行脱蜡后通过苏木素染液染色5 min,流水洗涤1 min,直至切片返蓝,经伊红染液染色3 min,流水冲洗掉伊红染液,梯度酒精脱水,二甲苯予以透明,用中性树胶施以封闭,光学显微镜下对肾组织的病理变化给予观察。

1.4肾功能相关指标 ①收集24 h尿液,选取双缩脲比色法检测24 h尿蛋白(UTP)水平;②通过苦味酸法检测血肌酐(Scr)水平;③使用速率法测定胱抑素(Cys)C、血尿素氮(BUN)水平;④使用溴甲酚绿法检测β2微球蛋白(β2-MG)表达。

1.5线粒体氧化应激、细胞活力及炎症水平检测 ①称取大鼠肾脏组织50～100 mg,除去髓质,固定于4%多聚甲醛,30 min,选用0.1% Triton X-100进行渗透(30 min),且在含Tween-20磷酸盐缓冲盐水内使用5%牛血清白蛋白予以封闭,将组织细胞使用75 nmol/L 溶酶体绿色荧光探针进行染色(北京伊塔生物科技有限公司,货号:YT07420),以此对溶酶体进行观察,通过250 nmol/L线粒体红色荧光探针观察线粒体。使用高分辨共聚焦显微镜(Nikon A1R HD25)对线粒体及溶酶体的共定位进行观察,将组织细胞和线粒体红色荧光探针5 μmol/L于37 ℃环境中培养10 min,并经荧光显微镜(上海富莱光学科技有限公司,型号:ECLIPSE MA100)检测570 nm发射波长及520 nm激发下各组的荧光强度。②细胞活力检测:处理组织细胞后,各孔添加CCK-8溶液(10 μl),将酶标板于37 ℃环境中培养2 h,使用自动酶标仪(北京东目仪器有限公司,型号:DJ15-M195407-Q3)检测460 nm波长处的吸光值。③炎症水平检测。收集各组眼球血1 ml,于4 ℃下行离心处理(3 500 r/min离心6 min),分离血清,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)对白细胞介素(IL)-8、IL-6水平进行检测,首先在检测卡中标记清对照组、模型组,将血清标本、稀释缓冲液及测试卡放置于平台,维持24～26 ℃室温,按比例1∶20对标准液予以稀释,添加标准液100 μl于酶标板内,混合均匀,恒温放约30 min,洗涤酶标板,加入50 μl抗体,放置30 min,滴加40 μl终止剂,用多功能酶标仪(厂家:北京东目仪器有限公司,型号:DJ15-M195407-Q3)对待测在酶标板波长460 nm处测吸光度值,试剂盒由北京义翘神州科技股份有限公司提供,货号为:10098-HNCH1、10398-H08H。

1.6肾间质纤维化指标水检测 收集大鼠1 ml眼球血,行离心处理(3 500 r/min离心8 min),提取血清,使用ELISA检测肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)-β1、同型半胱氨酸(Hcy)水平,试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供,货号为:F15644、F28310、F20071。其上述检测步骤均由具有丰富经验的专科医师按说明书完成。

1.7免疫组化法检测β-catenin、SFRP4表达 60 ℃烤片、2 h后,常规脱蜡、脱水,3% 过氧化氢密封内源性过氧化物、曲拉通破膜、柠檬酸缓冲液通过微波炉煮沸直至抗原改善、磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,一抗(β-catenin,1∶100;SFRP4,1∶100),在4 ℃冰箱中湿盒培养过夜,复温0.5 h,PBS洗涤3次,37 ℃培养对应的二抗60 min,PBS洗涤3次,二氨基联苯胺(DAB)显微镜下进行染色,流水洗涤,苏木素光镜下进行复染,清水洗涤,常规脱水透明,晒干,用中性树脂进行封片后,光镜下检测蛋白的水平表达。内参为β-actin。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0软件进行χ2检验、独立样本t检验、配对t检验。

2 结 果

2.1病理组织学观察 如图1所示,对照组肾小球及肾小管组织的形态正常。DN模型组肾小球系膜产生显著增生、肾小球基底膜有所增厚,显著肾纤维化,肾小球的囊腔缩减,且存在毛细血管积聚。

2.2两组肾功能相关指标对比 如表1所示,与对照组比较,DN模型组CysC、Scr、BUN、UTP、β2-MG水平均上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3两组肾间质纤维化指标水平对比 如表1所示,与对照组对比,DN模型组Hcy、TGF-β1表达上升,HGF表达下降,具有统计学差异(P<0.05)。

2.4各组线粒体氧化应激、细胞活力及炎症水平对比 如表2所示,与对照组比较,DN模型组相对线粒体ROS、IL-8、IL-6表达升高,细胞活力降低,具有统计学差异(P<0.05)。

2.5两组β-catenin、SFRP4表达水平对比 如表2、图2所示,与对照组对比,DN模型组β-catenin、SFRP4表达升高,具有统计学差异(P<0.05)。

图1 两组肾组织(HE染色,×400)

表1 两组肾功能相关指标及肾间质纤维化指标对比

表2 两组线粒体氧化应激、细胞活力、β-catenin、SFRP4表达及炎症水平对比

图2 Western印迹检测两组β-catenin、SFRP4蛋白表达

3 讨 论

随着病情的进展,DN可引起患者产生终末期肾衰竭,甚至发生死亡。且因DN患病率高,治疗时间较长且预后疗效较差等特征,给临床治疗带来了较大的困难〔9～11〕。

由于肾脏中含有较为丰富的线粒体,故而线粒体的正常功能对保证肾功能良好发挥了较为重要的作用〔12〕。在正常状况下,机体会选择性的消退被损害及功能失衡的线粒体,从而保证细胞的平稳性,因此,长期受高糖的刺激会导致线粒体极易受损,使得活性氧提升,线粒体膜电位降低,致使线粒体功能异常,大量功能失衡的线粒体会在细胞中聚积,造成细胞内的环境失衡,致使细胞发生反应,如纤连蛋白及细胞外基质内Ⅳ型胶原蛋白的积聚,从而造成肾纤维化,纤维化为DN的重要病理改变之一〔13,14〕。线粒体自噬可通过消除功能失衡及被损害的线粒体,为线粒体质量把控的主要途径〔15〕。故而提升线粒体自噬可及时性的除去受损的线粒体以保持细胞的平衡及线粒体功能异常,进而减少细胞外基质的积聚,以改善DN大鼠病症。线粒体功能异常在调节氧化应激、炎症水平及细胞凋亡方面发挥着重要的作用,这与DN的发病机制密切相关。

SFRP为近来新研究发现的分子量为40 kD的一种可溶性脂肪细胞因子,可参与调节Wnt信号通路,而Wnt信号通路被证实可诱导DN的发生,抑制Wnt信号通路表达可作为潜在治疗DN的重要靶点〔16,17〕。研究发现〔18〕,SFRP1参与早期DN的患病过程。研究显示〔19〕,SFRP5与糖尿病肾病的病症严重程度的发展有着紧密联系。研究发现〔20〕,SFRP4参与骨代谢、恶性肿瘤、胰岛素抵抗、糖尿病等。本文发现,SFRP4通过介导线粒体自噬,可有效减缓DN的进展,改善肾功能指标,抑制肾间质纤维化的发展,控制血糖,以减轻DN的严重程度,与其他相关学者研究较相似〔21～23〕;表明SFRP4下降可有效抑制DN大鼠肾组织中线粒体自噬能力过度,这一病理变化可能与改善线粒体功能异常过程有关。以后可进一步探究SFRP4如何对线粒体自噬进行有效调节,旨在确定SFRP4在DN进展中的临床意义及潜在作用机制。