前列地尔联合CRRT对急性肾衰竭患者肾血流及自噬相关蛋白的影响

刘静梅 柴海霞 王会军 王印华 郭炜妍

(1唐山市协和医院,河北 唐山 063000;2华北理工大学附属医院;3唐山南湖医院)

急性肾衰竭(ARF),又称急性肾损伤(AKI),通常发生在病危的住院患者身上〔1～3〕。当肾脏停止运作时,原本要从血液中过滤掉的尿素、肌酐和其他物质开始积聚进而引发排尿减少、恶心、疲劳、呼吸急促和由于液体滞留而肿胀甚至危及生命等的一系列症状。ARF的发病原因大致分为肾前性(由流向两个肾脏的血流量减少引起)、内在性(由肾脏损伤引起)或肾后性(最常见的是尿路梗阻)3种。ARF治疗通常采用升压药物以帮助升高血压、静脉输液以帮助补液、利尿剂以增加尿量及血液透析以帮助在肾脏愈合时过滤血液等多种策略〔4～6〕。连续性肾脏替代治疗(CRRT)是目前临床上常用的有效治疗ARF的手段,能够模拟肾脏的清除模式,缓慢且持续地清除炎性介质,疗效确切,但费用较高〔7～9〕。前列地尔能够改善肾血流动力学进而增加尿量和尿钠排泄,同时有研究表明可以抑制细胞自噬,减轻组织损伤〔10,11〕。本研究探讨前列地尔联合CRRT对ARF患者肾血流及自噬相关蛋白表达的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年7月至2020年7月来唐山市协和医院治疗并且确诊为ARF患者104例。纳入标准:符合急性肾衰竭诊断标准〔12〕;近1个月无相关药物治疗史;非妊娠期或哺乳期妇女;排除标准:慢性肾功能不全基础上的ARF;肾移植患者;临终患者;心、肝、肾等内脏脏器功能异常;凝血功能受损;对治疗药物过敏者;合并恶性肿瘤、内科疾病、感染及其他自身免疫性疾病。患者随机分为对照组和观察组各52例,其中对照组男29例,女23例;平均年龄(44.1±5.9)岁;平均病程(12.5±1.5)d;平均急性生理与慢性健康评估(APACHE)Ⅱ评分(21.55±1.8)分,观察组男25例,女27例;平均年龄(45.9±7.5)岁;平均病程(12.5±1.3)d;平均APACHEⅡ评分(21.61±1.7)分。两组一般资料无明显差异(P>0.05)。所有患者知晓该研究且签署同意书,该方案通过医院伦理委员会的批准。

1.2研究方法 两组均积极控制原发病因,给予营养支持控制体内的水、电解质和酸碱平衡,并严格控制感染。对照组给予CRRT,采用Aquarius CRRT血液净化机(美国Baxter公司),置换液采用前后稀释输入氯化钠置换液的方法,患者血流量保持在150～250 ml/min,输入速度保证在2 000～3 000 ml/h,每天8～12 h,使用肝素或者低分子肝素抗凝,出现出血倾向时选择无肝素或体外肝素法,治疗持续3～5 d。治疗期间每日早晨采集患者空腹动脉血、外周静脉血及尿液进行检测。研究组在给予CRRT的基础上静脉滴注前列地尔注射液(商品名:凯时,生产企业:北京泰德制药股份有限公司;批准文号:国药准字H10980023,规格:1 ml∶5 μg),静脉注射,1次/d,10 μg/次。两组均连续治疗7 d。

1.3肾功能指标 采集两组治疗前后空腹晨尿,采用散射比浊法检测尿液中的尿β2-微球蛋白(MG),采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿肾损伤分子(Kim)-1,试剂盒来自美国R&D Systems公司,检测设备选用多功能酶标仪(ELX800,美国伯腾公司)。采集两组治疗前后的空腹静脉血,采用全自动生化分析仪(Indiko Plus,美国赛默飞世尔科技公司)检测血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)蛋白表达水平。

1.4肾血流指标 采用彩色多普勒超声仪(DW-F5,大为医疗有限公司)检测肾动脉内径及主肾动脉收缩期最高流速(PSV)、舒张末期流速(EDV),计算肾血流阻力指数(RI)=(PSV-EDV)/PSV。

1.5炎症因子指标 采用ELISA检测患者治疗前后空腹静脉血白细胞介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1蛋白表达,试剂盒来自美国R&D Systems公司,检测设备选用多功能酶标仪(ELX800,美国伯腾公司)。

1.6自噬相关蛋白指标 采用Western印迹检测患者治疗前和治疗后自噬效应蛋白(Beclin)-1、微管相关蛋白1轻链(LC3)-Ⅱ和自噬相关蛋白(Atg)5在单核细胞中的表达水平。分别于治疗前和治疗后抽取患者空腹静脉血于肝素抗凝管中,加入Ficoll淋巴细胞分离液,12 000 r/min离心20 min,将离心后的交界面处的单核细胞收集到0.5 ml的离心管中,储存于-80 ℃冰箱中。冷冻后向其中加入Trizol溶液(美国Thermo Fisher Scientific公司)按照使用说明提取单核细胞的mRNA,随后采用PrimeScriptTMRT Master Mix(日本TaKaRa Bio公司)将其逆转录成cDNA。经电泳、转膜、封闭。用相应的Beclin-1、LC3-Ⅱ和Atg5一抗按比例稀释后4 ℃孵育过夜,将稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗与膜孵育1 h。用电化学发光(ECL)试剂盒显影,用Quantity One专业灰度分析软件分析条带灰度值。以Beclin-1、LC3-Ⅱ和Atg5与β-actin的灰度值比值确定蛋白表达的相对水平。

1.7统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组临床疗效比较 治疗后,对照组半年死亡率(46.15%,痊愈4例,好转13例,无效11例,死亡24例)与观察组(36.54%,痊愈6例,好转18例,无效9例,死亡19例)无明显差别(χ2=0.991,P=0.319)。

2.2两组肾功能指标比较 治疗前,两组肾功能指标β2-MG、NAG、Kim-1、BUN、Scr水平均无统计学差异(P>0.05)。治疗后,两组β2-MG、NAG、Kim-1、BUN、Scr水平较治疗前均显著降低,且观察组水平明显低于对照组(均P<0.001)。见表1。

表1 两组肾功能指标比较

2.3两组肾血流指标比较 治疗前,两组肾动脉内径和肾血流阻力指数比较无明显差异(P>0.05)。治疗后,两组肾动脉内径均显著增大,肾血流阻力指数均明显下降,且观察组比对照组水平变化更明显(P<0.01,P<0.001)。见表2。

2.4两组炎症因子指标比较 治疗前,两组炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α和MCP-1表达水平比较无明显差异(P>0.05)。治疗后,两组炎症因子水平均显著下降,且观察组比对照组降低程度更大(均P<0.001)。见表2。

2.5两组自噬相关蛋白指标比较 治疗前,两组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ和Atg5 mRNA表达水平比较无明显差异(P>0.05)。治疗后,两组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA表达水平均显著下降,且观察组比对照组降低程度更大(均P<0.001)。见表3。

表2 两组肾血流指标及炎症因子比较

表3 两组自噬相关蛋白相对mRNA水平比较

3 讨 论

ARF具有较高的发病率和死亡风险。在ARF中,肾小球滤过率在数天至数周内急速下降,含氮废物的排泄减少,机体无法维持体液和电解质平衡,进而引发各脏器并发症甚至导致死亡〔13,14〕。ARF造成的死亡最常由感染或心肺并发症引起,根据肾衰竭的严重程度,死亡率可以从7%到高达80%。由于ARF患者通常年龄较大且并发症更多,在过去的40年中其生存率并没有提高。ARF患者通常无症状,可通过观察血尿素氮和血清肌酐水平的急剧升高来诊断病情〔15,16〕。

目前,临床上治疗ARF危重患者多采用多种肾脏支持方式,包括CRRT、常规间歇性血液透析(IHD)和延长的间歇性肾脏替代疗法(PIRRT)等,其中CRRT通过最大程度模拟肾脏的清除模式,能够稳定肾血流动力学,缓慢且持续地清除溶质及炎性介质,且研究表明其治疗效果与APACHEⅡ评分和炎症因子水平等因素有关〔17,18〕。已有研究表明,给ARF患者输注前列地尔可以改善肾血流动力学进而增加尿量和尿钠排泄。自噬是一种通过将受损蛋白质、长寿命蛋白质、蛋白质复合物和细胞器动员到溶酶体从而维持细胞稳态的自噬分解代谢过程〔19,20〕。研究表明,在急性肾损伤时自噬体可以通过提高反应性对肾脏起到保护作用,同时在恢复期通过促进细胞增殖对肾小管起到再生和修复作用。而Beclin-1、LC3-Ⅱ和Atg5等自噬相关蛋白反映了自噬体的反应性,当自噬相关蛋白表达水平提高时,表明细胞自噬增强〔21～23〕。

本研究结果说明,前列地尔联合CRRT对于肾功能的改善更加显著,前列地尔联合CRRT极大地改善了肾血流动力学。是因为前列地尔作为前列腺素 E1激动剂能够通过对肾血管和动脉导管平滑肌的直接作用促进血管舒张,降低肾血管阻力。炎症反应在ARF的病程发展中起到重要作用。本研究结果表明,在CRRT有效清除炎症介质的基础上前列地尔能够进一步减轻肾脏炎性反应,缓解肾脏损伤;前列地尔的加入对于抑制ARF患者的细胞自噬起到了关键作用。本研究中前列地尔通过抑制细胞自噬改善肾功能,减轻肾组织损伤,其具体机制有待研究。